Анализ молекулярных процессов в живых клетках с пространственным разрешением менее 10 нм

Исследователи из Вюрцбургского университета разработали «анализ фоточувствительных отпечатков» — уникальную технологию, которая впервые позволяет анализировать молекулярные процессы и регуляцию отдельных белков в живых клетках с пространственным разрешением менее 10 нм. Её применение простирается от биологических до медицинских исследований. Работа опубликована в Nature Methods.

Преодоление динамических ограничений разрешения

Новый метод, разработанный группой профессора Маркуса Зауэра и доктора Герти Белиу, позволяет оптическую визуализацию динамических взаимодействий молекул в клетке. «До сих пор не существовало метода, который бы надежно позволял достичь структурного оптического разрешения в клетках в диапазоне менее 10 нм. Выяснив первопричину этого барьера, нам впервые удалось в сочетании с новыми методами прямой маркировки обеспечить клеточное разрешение в несколько нанометров», — сообщает Зауэр.

Методы микроскопии с локализацией одиночных молекул, такие как dSTORM, позволяют разрешение в диапазоне 10–20 нм. Однако высокая точность локализации (до 1 нм) не могла быть преобразована в пространственное разрешение в несколько нанометров в клетках.

Проблема в том, что современные методы мечения (например, иммуноокрашивание антителом) вызывают ошибку расстояния более 10 нм. Другой причиной барьера разрешения менее 10 нм были неизвестные энергетические процессы. «Мы впервые показали, что скорости фотопереключения красителей между состояниями "включено" и "выключено" сильно меняются на расстояниях менее 10 нм из-за различных процессов переноса энергии между красителями. Это приводит к кластеру "включенных" состояний в первые секунды эксперимента и быстрому фотообесцвечиванию, что затрудняет их индивидуальную локализацию», — объясняет Зауэр.

След флуоресцентной интенсивности

Однако фотоотпечаток и время затухания флуоресценции также содержат информацию о количестве присутствующих красителей и, благодаря зависимости переноса энергии от расстояния, информацию об их расстояниях, без возможности оптического разрешения отдельных красителей.

Включив неестественные аминокислоты в мультимерные мембранные рецепторы с помощью расширения генетического кода с последующей биоортогональной клик-меткой небольшими флуоресцентными красителями, исследователи смогли добиться специфической сайт-специфичной маркировки белков в клетках без ошибок расстояния при дистанциях менее 10 нм. «Анализируя фотоотпечатки мультимерных рецепторов в плазматической мембране, мы смогли впервые оценить расстояния между субъединицами рецепторов в диапазоне 5–7 нм в клетках и определить количество меченых субъединиц», — говорит Белиу.

Визуализация и понимание молекулярной коммуникации

Следующим шагом команда намерена оптимизировать анализ фотоотпечатков и использовать его в сочетании с микроскопией локализации одиночных молекул и DNA-PAINT для надежной сверхразрешающей визуализации в клетках с разрешением менее 10 нм. Это должно дать новое понимание молекулярной организации клеточных структур, органелл и мультибелковых комплексов.

Новый метод предлагает уникальные возможности для изучения молекулярных механизмов в исследованиях инфекций, липидов и рака. Фотоотпечатки также имеют потенциал для более реалистичного отображения динамики и сложности рецепторов в нервной системе, важных для передачи сигналов в синапсах нейронов. «Поэтому принципиально важно понять, как собирается и функционирует этот молекулярный оркестр», — говорит Белиу, описывая значимость этих исследований.