С нанотрубками генная инженерия растений становится простой

Новая методика, разработанная учёными Калифорнийского университета в Беркли, может сделать генетическую инженерию любых растений — в частности, редактирование генов с помощью CRISPR-Cas9 — простой и быстрой.

Для доставки гена исследователи присоединяют его к углеродной нанотрубке, которая достаточно мала, чтобы легко проникать через жёсткую клеточную стенку растения. До сих пор большинство генетических модификаций растений выполнялось либо путём "выстреливания" генов в ткань (биобаллистика), либо с помощью бактерий. Оба метода успешны лишь в небольшом проценте случаев, что является серьёзным ограничением.

Нанотрубки же высокоэффективны для доставки гена как в ядро, так и в хлоропласт — структуру клетки, которую ещё сложнее поразить существующими методами. Простая методика доставки генов стала бы прорывом для учёных, пытающихся повысить эффективность захвата световой энергии для увеличения урожайности.

Нанотрубка не только защищает ДНК от деградации клеткой, но и предотвращает её встраивание в геном растения. В результате методика позволяет производить модификации или делеции генов, которые в США и странах за пределами Евросоюза не подпадали бы под определение "генетически модифицированный организм" (ГМО).

"Одним из преимуществ является просто экономия времени с такой технологией, — сказала Маркита Ландри, доцент химической и биомолекулярной инженерии. — Но я думаю, главным достижением станет возможность быстро и эффективно доставлять гены в растения разных видов и таким образом, который позволит получать трансгенные линии растений без интеграции чужеродной ДНК в их геном".

Ключевым применением станет редактирование генов CRISPR-Cas9: доставка гена Cas9 (фермента, который находит и разрезает ДНК) вместе с ДНК, кодирующей направляющую РНК ("адресную метку" для Cas9), для высокоточного редактирования конкретных генов. ДНК, связанная с нанотрубкой, очень стабильна.

"Мы оценили стабильность конструктов и стоимость, и по обоим параметрам это подходит для "гаражной науки", — отметила Ландри. — Их можно положить в конверт и отправить куда угодно. Не нужен холодильник, генная пушка, бактерии; для работы с ними нужно очень мало, и они стабильны месяцами. Мы можем производить их в больших масштабах, замораживать, размораживать — они крепкие штучки".

Ландри и её коллеги сообщат о своих результатах онлайн 25 февраля перед публикацией в журнале Nature Nanotechnology.

Доставка CRISPR

Ландри обнаружила, что нанотрубки легко проникают через клеточные стенки растений, пытаясь пометить клетки нанотрубочными сенсорами. Сенсоры оказались внутри клетки, а не на её поверхности.

Она сразу поняла, как использовать это для доставки генов в растения. Существующие методы громоздки и часто малоэффективны. Использование генных пушек разрушительно; это как пробить дыру в растительной клетке и надеяться, что и ген, и клетка выживут. Не все растения могут быть инфицированы Agrobacterium, несущим гены, а другой метод — использование патогенных вирусов — работает для ещё более узкого круга растений и рискует встроить вирусную ДНК в геном растения. Все методы требуют адаптации под каждый конкретный вид, а доставляемая ДНК интегрируется в геном — что и является определением ГМО.

Ландри и её коллеги обернули ген зелёного флуоресцентного белка (GFP) вокруг нанотрубки и ввели его в лист органического рукколы, купленного в местном магазине Whole Foods Market. В течение дня клетки растения засветились зелёным под УФ-светом, что указывало на транскрипцию гена GFP и трансляцию в белок, как если бы это был собственный ген растения.

Однако эффект длился всего несколько дней, вероятно, из-за рециркуляции белков и медленной деградации ДНК.

Но короткое время жизни — не недостаток.

"Часть уникальности этой платформы в том, что экспрессия является временной. Когда мы смотрим в микроскоп через 7–10 дней, экспрессия исчезает, флуоресценция пропадает. В случае с Agrobacterium этого не происходит", — пояснила Ландри. Для учёных, изучающих работу растений, кратковременная экспрессия гена может многое рассказать о его роли в клетке.

"Однако для того, чтобы эта платформа получила широкое применение, нам нужно экспрессировать белок, который сам по себе оказывает постоянное воздействие на ядерный геном", — добавила она.

Её план — упаковать ДНК в одноцепочечную плазмиду, которая затем присоединяется к углеродной нанотрубке. В течение двух-трёх дней после проникновения в клетку будут экспрессированы и белок Cas9, и направляющая РНК CRISPR, что позволит им объединиться в рибонуклеопротеиновый комплекс для постоянного редактирования генома. Токсических эффектов от нанотрубок обнаружено не было.

"Таким образом, вы получаете отредактированное растение, которое за пределами Европы не будет считаться ГМО", — сказала она.

Зарядка нанотрубки

Она и её коллеги протестировали доставку с помощью нанотрубок на других растениях: табаке (рабочей лошадке растительной генетики), хлопке (чей геном печально известен сложностью) и пшенице. Генетически модифицированные версии этих растений уже существуют на рынке, но упрощённая методика могла бы ускорить внедрение новых полезных генов.

Хотя Ландри и её коллеги ещё не до конца понимают механизм доставки, лёгкое проникновение нанотрубок не стало для неё полной неожиданностью. Клеточные стенки растений легко пропускают объекты размером менее 5–20 нанометров, что значительно меньше предела в 500 нанометров для клеток млекопитающих. Диаметр нанотрубок составляет около 1 нанометра, хотя их длина — около 300 нанометров: этого достаточно, чтобы прикрепить десятки генов. Размер растительных клеток составляет порядка 10 000 нанометров.

Она и её коллеги опробовали различные методы прикрепления ДНК к нанотрубкам и обнаружили, что лучше всего работает самое прочное связывание. Когда исследователи придавали нанотрубке положительный заряд перед введением ДНК, она прилипала, как бумага к расчёске, заряженной статическим электричеством.

Сейчас она проводит эксперименты с наночастицами ДНК-оригами, чтобы лучше понять, что происходит внутри растительных клеток после проникновения нанотрубки и ДНК, и экспериментирует с доставкой в растения других типов молекул, в частности РНК и белков.

"Удивительно в этих углеродных нанотрубках то, что они способны преодолевать клеточную стенку и проникать в ядро или хлоропласты. Это новое достижение, которое позволяет нам действительно внедрить инструменты для редактирования генома", — сказал Брайан Стаскавич, профессор биологии растений и микробов и научный директор по сельскому хозяйству Инновационного института геномики, который финансирует дальнейшую работу Ландри и её команды по доставке CRISPR. "Следующие шаги: сможем ли мы доставлять рибонуклеопротеины или мРНК, или ДНК, которая фактически будет кодировать CRISPR-Cas9?"