Новый метод прямой секвенирования малых геномов без подготовки библиотек

Впервые исследователи секвенировали молекулы ДНК без необходимости стандартного этапа подготовки библиотек.

Используя этот подход, учёные получили последовательности, используя значительно меньше ДНК, чем требуется стандартными методами — даже менее одного нанограмма. Это в 500 раз меньше ДНК, чем нужно по стандартным протоколам.

Библиотеки — это коллекции фрагментов ДНК, полученных из образцов с помощью молекулярно-биологических методов. Их подготовка трудоёмка, отнимает время и часто требует много ДНК. Новая техника может значительно сократить расход ДНК и время, необходимое для получения данных секвенирования малых геномов.

"Это первый случай, когда кому-либо удалось напрямую секвенировать отдельные молекулы ДНК таким образом", — говорит доктор Пол Коупленд, первый автор из Института Сэнгера. Мы применили наш подход к секвенированию геномов вирусов и бактерий и обнаружили, что даже при относительно низком уровне оптимизации смогли определить, какие организмы мы изучаем, присутствуют ли в образце специфические гены или плазмиды (что важно для определения антибиотикорезистентности), а также другую информацию, например, модификации специфических оснований ДНК.

"После оптимизации наша методика имеет большой потенциал для быстрого и эффективного определения организмов в больницах и других медицинских учреждениях. Она также даёт абсолютную уверенность в отсутствии смещения в данных из-за подготовки библиотеки, просто потому что библиотека никогда не создавалась".

Команда использовала систему PacBio RS, которая секвенирует отдельные молекулы ДНК, для прямого подхода. Данные были получены для небольших кольцевых одноцепочечных и двухцепочечных вирусных геномов, а также для линейных фрагментов, покрывающих весь геном штамма Staphylococcus aureus MRSA.

Команда попробовала проанализировать геном одного организма, используя всего 800 пикограмм ДНК — более чем в 600 раз меньше, чем количество, используемое в стандартной практике. В этом примере PacBio сгенерировал только 70 ридов (фрагментов последовательности) генома. Хотя это лишь малая доля от числа ридов, генерируемых стандартными методами с библиотеками, этой информации всё равно хватило, чтобы идентифицировать конкретный секвенируемый организм. Эта работа может позволить выявлять в метагеномных образцах организмы, которые ранее были необнаружимы.

"Чтобы секвенировать микроорганизмы, сначала нужно уметь выращивать их в лаборатории", — говорит доктор Тамир Чандра, ведущий автор из Института Бэбрахама. — "Это не только отнимает много времени, но иногда микроорганизмы не растут, что крайне затрудняет секвенирование их генома. С помощью этого метода мы можем напрямую секвенировать эти организмы и выяснить их идентичность за короткое время".

"Наша роль в Институте Сэнгера — определить, как мы можем использовать и улучшать эти платформы секвенирования для более эффективного получения биологической информации и, в свою очередь, возможно, влиять на контроль и лечение заболеваний и инфекций", — говорит доктор Гарольд Свердлоу, ведущий автор из Института Сэнгера. — "Нашу технику можно выполнять без какого-либо предварительного знания о последовательности и без организм-специфичных реагентов, за короткое время. Это делает её многообещающей альтернативой для клинических ситуаций, таких как контроль инфекций".