Исследование раскрывает факторы эффективного и точного редактирования ДНК
Исследователи из Института эволюционной антропологии Общества Макса Планка решили давнюю проблему в CRISPR-редактировании генома — точное предсказание активности направляющих РНК (gRNA).
В отличие от предыдущих инструментов прогнозирования, которые обучались на транскрибированных gRNA и были подвержены транскрипционным смещениям, новый подход фокусируется на химически синтезированных gRNA, которые широко используются в исследованиях и, вероятно, станут предпочтительным форматом для клинического применения.
В исследовании, опубликованном в журнале Nature Communications, учёные разработали простую линейную модель под названием EVA score, которая может надёжно предсказывать активность gRNA в разных типах клеток и наборах данных.
"Химический синтез позволяет избежать некоторых последовательностно-зависимых проблем транскрибированных gRNA", — говорит руководитель исследования Штефан Ризенберг. — "Это различие, в сочетании с более точным количественным определением результатов CRISPR-расщепления в клетках, позволило нам построить простую прогнозную модель, которая обобщается для разных типов клеток".
Авторы предварительно рассчитали EVA-баллы для всех gRNA в геномах человека и мыши, и к ним можно легко получить доступ через онлайн-треки в геномных браузерах.
Помимо предсказания активности gRNA, исследование стало пионером в создании новой модели эффективности репарации, направляемой гомологией (HDR), что является полезным достижением для задач точного редактирования генома, таких как коррекция точковых мутаций. Авторы выявили особенности последовательности, значительно влияющие на успех HDR, такие как неправильное сворачивание донора и тип нуклеотидного изменения, что позволяет достичь эффективности HDR до 78% в оптимальных условиях.
Помимо эффективности редактирования, исследование также затрагивает проблемы безопасности, критически важные для терапевтического применения. Изучив результаты редактирования CRISPR-Cas9 и Cas12a, исследователи обнаружили высокую распространённость скрытых событий репарации — геномных изменений, не обнаруживаемых стандартными ПЦР-анализами, которые включают крупные делеции и идеально отремонтированные разрывы, неотличимые от немодифицированной ДНК.
Важно отметить, что исследование показало, что Cas12a, как правило, способствует идеальной репарации, а не масштабным повреждениям, что потенциально делает его более безопасным, чем Cas9, для терапевтического использования. Структурное различие в расщеплении ДНК — Cas12a генерирует ступенчатые разрезы с "липкими концами" — может объяснять разницу в результатах репарации.
Результаты имеют важное значение для CRISPR-исследований и терапий, предлагая инструменты для разработки более эффективных и безопасных стратегий редактирования генома.