Учёные могут редактировать несколько фрагментов генома одновременно
Теперь учёные могут одновременно редактировать несколько участков генома, чтобы понять, как различные участки ДНК взаимодействуют в здоровье и болезни.
Редактирование ДНК на основе CRISPR произвело революцию в изучении человеческого генома, позволив точно удалять любые гены для понимания их функции. Однако одна возможность оставалась сложной — одновременное удаление нескольких генов или их фрагментов в одной клетке. Такое «геномное хирургическое вмешательство» ключевое для понимания, как разные части генома работают вместе как в норме, так и при болезни.
Теперь такой инструмент создан командами Бенджамина Бленкоу и Джейсона Моффата, профессоров молекулярной генетики в Центре клеточных и биомолекулярных исследований Доннелли. Метод, названный CHyMErA (Cas Hybrid for Multiplexed Editing and Screening Applications), применим к любому типу клеток млекопитающих для системного одновременного нацеливания на ДНК в нескольких позициях, как описано в исследовании, опубликованном в журнале Nature Biotechnology.
CRISPR, часто называемый «геномными ножницами», направляет ДНК-разрезающий фермент в нужные участки генома с помощью молекул РНК-гидов. Наиболее широко используемый фермент — Cas9.
С момента открытия Cas9 учёные нашли другие ферменты Cas с разными свойствами. В отличие от CRISPR-Cas9, CHyMErA комбинирует два разных ДНК-разрезающих фермента — Cas9 и Cas12a, что позволяет более универсальное применение. Cas12a может генерировать несколько РНК-гидов в одной клетке, что ключевое для одновременного редактирования.
Томас Гонатопулос-Пурнатзис, научный сотрудник в группе Бленкоу, несколько лет пытался разработать комбинаторное редактирование генов, тестируя Cas9 и Cas12a по отдельности. Затем у него появилась идея объединить эти ферменты, чтобы создать систему CHyMErA.
«Мы перепробовали множество подходов для индукции делеций генетических фрагментов, и ничто не работало так хорошо, как CHyMErA», — говорит он.
Следующим шагом стало использование CHyMErA в крупномасштабных скринингах для системного анализа того, как гены действуют вместе, а также функций отдельных частей генов.
«С CHyMErA вы можете использовать лучшее от двух ферментов, — говорит Майкл Ареггер, научный сотрудник лаборатории Моффата. — Cas9 был улучшен сообществом для очень высокой эффективности редактирования, тогда как Cas12a позволяет мультиплексировать РНК-гиды, обеспечивая гораздо больше гибкости в поиске сайтов в геноме для разрезания».
Применение метода
В одном из применений CHyMErA исследователи нацелились на пары генов, известных как паралоги, которые имеют схожий код ДНК, но плохо изучены из-за сложности исследования. Поскольку паралоги возникли путём дупликации предкового гена, предполагалось, что их роли схожи. Но их функцию не удавалось раскрыть существующими методами, нацеленными на один ген, в основном потому, что один паралог компенсировал отсутствие другого.
«С CHyMErA мы можем удалить оба паралога в паре, чтобы увидеть, важна ли эта предковая функция для выживания клетки, — говорит Кевин Браун, старший научный сотрудник лаборатории Моффата. — Теперь мы можем исследовать класс генов, который ранее упускали».
После нокаута ~700 пар паралогов (почти всех существующих в человеческом геноме) анализ подтвердил, что многие из этих пар действительно выполняют схожие роли в выживании клетки, тогда как другие имеют отличные функции.
Другая особенность CHyMErA — возможность направлять Cas9 и Cas12a на близлежащие участки генома, чтобы вырезать фрагменты генов, такие как экзоны. Это позволило команде индивидуально удалить тысячи экзонов, связанных с раком и функцией мозга, которые ранее не поддавались нацеливанию только с Cas9.
Из 2000 экзонов, проанализированных с помощью CHyMErA, более 100 оказались критически важными для выживания клетки, что позволяет будущим исследованиям сосредоточиться на выяснении их потенциальной роли в заболеваниях.
«Как только мы идентифицируем экзоны, играющие критическую роль в болезни, мы сможем использовать эту информацию для разработки новых терапий», — говорит Гонатопулос-Пурнатзис.