Систематический поиск регуляторных элементов в ДНК указывает на ограничения предыдущих представлений
Кодирующие белки участки ДНК составляют лишь около 1% генома. Остальные 99% содержат последовательности, регулирующие экспрессию генов, то есть определяющие, какие кодирующие участки и когда будут транслированы в белки.
В новом номере Nature Biotechnology исследователи из MIT и Гарвардской медицинской школы описывают новую технику для систематичного и эффективного поиска регуляторных элементов в длинных участках генома. В её первом применении они нашли свидетельства, что текущие представления о регуляции генов неполны.
"Обычные методы вырезали небольшие кусочки генома и проверяли, достаточно ли их для запуска экспрессии гена", — говорит Дэвид Гиффорд, профессор MIT и один из старших авторов статьи. — "У этого два ограничения. Во-первых, если что-то достаточно для активации гена, это не значит, что оно необходимо. И наоборот. Во-вторых, эти анализы не проводятся в нативном контексте — вырезанные сегменты ДНК не находятся в своём обычном месте в геноме. Мы же хотели напрямую проверить необходимость геномной последовательности в её естественном контексте — в клетке, на своём обычном месте. Мы мутируем её прямо там, где она обычно функционирует".
Неотмеченные пути
В последние годы одним из основных методов идентификации регуляторных элементов было использование так называемых гистоновых меток — модификаций (например, добавления ацетильных или метильных групп) на концах гистоновых белков, вокруг которых намотана ДНК. Определённые метки ассоциируются с подавлением или активацией экспрессии генов.
Однако новая техника исследователей из MIT и Гарварда выявила участки генома, которые, по-видимому, играют ключевую роль в регуляции генов, но ранее не ассоциировались с гистоновыми метками.
"Эта работа демонстрирует, что важно тщательно обдумывать наши допущения", — говорит Гиффорд. — "Она не опровергает их категорически, но требует дальнейшего изучения того, что необходимо для геномной функции".
Техника на основе CRISPR
Техника Гиффорда и его коллег — это применение системы редактирования генов CRISPR. Исследователи нашли способ делать разрезы ДНК через равные интервалы вокруг интересующего кодирующего участка. В статье они сообщают об экспериментах, в которых они исчерпывающе просканировали участки в десятки тысяч пар оснований вокруг четырёх известных кодирующих регионов.
Для этого они разработали 4000 направляющих РНК (guide RNAs) — небольших биологических молекул, которые направляют фермент CRISPR к нужным местам в геноме. Каждая направляющая РНК производилась внутри клетки из поглощённого ею ДНК-шаблона. В среднем каждый шаблон попадал примерно в 1000 клеток. Каждая клетка превращала ровно один шаблон в направляющую РНК, которая направляла CRISPR на специфичное место в геноме.
В каждом из этих мест фермент CRISPR разрезал ДНК. Когда клетки пытались восстановить разрывы, последовательности ДНК в местах репарации повреждались. В некоторых случаях это повреждение препятствовало производству соответствующих белков, указывая на функционально важные регионы.
Результаты
Вокруг каждого из четырёх исследованных кодирующих последовательностей учёные обнаружили несколько участков длиной примерно в 1000 пар оснований, которые показали явные признаки регуляторной активности, но которые ранее не были идентифицированы с помощью гистоновых меток.
Гиффорд предполагает, что эти участки могли присутствовать только в подмножестве клеток, и на них действительно могли быть гистоновые метки. Стандартная техника идентификации гистоновых модификаций опирается на усреднённые измерения по всей популяции клеток и может пропускать такие "выбросы". Исследователи продолжают изучать эти регионы, чтобы определить, что именно в них происходит.