Ученые разработали более быстрый метод поиска скрытых генетических «переключателей»
Исследователи из Центра Макса Дельбрюка разработали новый метод для изучения того, как ДНК контролирует гены. Их техника, опубликованная в Cell Genomics, позволяет быстрее, чем существующие методы, выявлять генетические «переключатели», регулирующие важные гены.
Большая часть человеческого генома не кодирует белки. Вместо этого она состоит из регуляторных областей. Как выключатели, которые включают и выключают свет, эти области нуклеотидов — называемые транскрипционными энхансерами — определяют, где и когда ген активен, и в значительной степени контролируют, сколько соответствующего белка производит клетка.
Дефекты в генетическом коде таких регуляторных элементов могут вызывать нарушения развития и болезни. Но по сравнению с кодирующими белок областями их сложнее идентифицировать, поскольку они часто расположены далеко от регулируемых ими генов и не имеют четкого генетического кода.
Ученые под руководством доктора Дубравки Вучичевич из лаборатории вычислительной и регуляторной геномики профессора Уве Олера создали мощный новый инструмент для обнаружения этих областей, контролирующих наши гены.
Метод называется targeted single-cell activation screen (TESLA-seq). Он сочетает CRISPR-активацию генов (CRISPRa) — технику регуляции генов, использующую модифицированную систему CRISPR-Cas9 для усиления экспрессии специфических генов — и таргетное секвенирование РНК единичных клеток, чтобы идентифицировать регуляторные области быстрее и точнее, чем другие методы.
«С помощью этого метода мы можем фактически проверить, как тысячи кандидатных регуляторных элементов в геноме способны включать гены — и выяснить, на какие именно гены они влияют», — говорит Вучичевич, ведущий автор исследования.
Картирование регуляторных элементов
В качестве демонстрации метода исследование сосредоточилось на гене PHOX2B, который необходим для развития нервной системы. Мутации в этом гене связаны с нейробластомой — раком нервной ткани, который в основном поражает детей.
Ученые сконцентрировались на большой области вокруг PHOX2B, создав по 2–3 направляющих РНК (gRNA) для каждого 100-парного сегмента (участка ДНК), всего 46 722 gRNA. Этот набор исследовал весь геномный ландшафт гена PHOX2B и соседних генов на предмет их потенциальной роли в качестве регуляторных переключателей.
Затем каждую gRNA перенесли в отдельную клетку человеческой нейробластомы. gRNA указывала системе CRISPRa, куда направиться, и активировала любые регуляторные области, которые могли присутствовать в этом «участке». Было идентифицировано более 600 областей — названных CaREs (CRISPRa-responsive elements) — которые при активации изменяли рост клеток.
Затем команда детально изучила около 200 CaREs и использовала таргетное секвенирование РНК единичных клеток, чтобы считать как gRNA внутри каждой клетки, так и РНК, экспрессируемую соседними генами. Это позволило связать каждый CaRE с любым из более чем 70 генов в области PHOX2B, экспрессия которых изменилась в этой клетке. Также были обнаружены прямые связи между CaREs и важными регуляторами генов SHISA3 и APBB2, которые вовлечены в развитие рака и болезни Альцгеймера.
Неожиданно оказалось, что многие CaREs контролируют далеко расположенные гены, полностью «перепрыгивая» через ближайшие — это то, что часто упускают другие методы.
«TESLA-seq не просто фиксирует то, что происходит в одном типе клеток, он может выявлять потенциальные связи между генами и регуляторными областями в разных биологических системах», — говорит Олер.
Это важно, поскольку многие болезни затрагивают более одного типа ткани, добавляет Вучичевич.
«Метод можно использовать для изучения обширных, неизведанных частей нашей ДНК, которые влияют на здоровье и болезни в нескольких системах органов, и он может помочь нам разрабатывать более точные и эффективные методы терапии».