Новая методика точно показывает, как регуляторные РНК контролируют активность генов
Исследователи из Стэнфордского университета разработали новую технику, позволяющую точно определять последовательности ДНК и места, с которыми связываются регуляторные РНК. Эта информация необходима для понимания того, как недавно идентифицированные молекулы РНК контролируют экспрессию соседних и удалённых генов.
Исследование даёт поразительное представление о сложном мире экспрессии генов и о том, как РНК, когда-то считавшаяся лишь клеточным «посыльным», активно «отпирает» наш ДНК-геном. «Раньше нам приходилось лишь предполагать, где действуют эти РНК, основываясь на их биологических эффектах», — сказал профессор дерматологии Ховард Чанг. «Теперь мы можем точно определить, где на хроматине они связываются. Мы обнаружили, что эти сайты многочисленны, специфичны по последовательности и локализованы».
Расшифровка роли регуляторных РНК критически важна для понимания многих клеточных функций, включая те, что участвуют в развитии, раке и регенерации.
Чанг, старший автор работы, опубликованной 29 сентября в Molecular Cell, и его лаборатория ранее идентифицировали одни из первых известных регуляторных РНК, включая HOTAIR в 2007 году. Первый автор исследования — аспирант Си Чу.
Пятьдесят лет назад исследователи впервые идентифицировали матричные РНК (mRNA), которые служат для передачи генетических инструкций от ДНК в ядре к белковосинтезирующему аппарату клетки. Со временем однонаправленный поток информации от ДНК к РНК и белку стал известен как «центральная догма» биологии. Регуляторные РНК бросают ей вызов, связываясь с ДНК и влияя на то, какие гены будут выбраны для производства белков.
Существование этих регуляторных РНК, также называемых длинными межгенных некодирующими РНК (lincRNA), впервые было постулировано десятилетия назад. Исследователи поняли, что ДНК, упакованная в хроматин (спиральный комплекс ДНК и белков), содержит более чем в два раза больше РНК по весу, чем ДНК. Они задались вопросом, не регулирует ли РНК, покрывающая хроматин, активность включения и выключения конкретных генов. Однако технические сложности до сих пор мешали точно определить сайты связывания.
«Чтобы запечатлеть эту картину, нужно поймать взаимодействие между lincRNA и хроматином в живых клетках», — сказал Чанг. «Совершенно не было очевидно, как это сделать».
В итоге Чу разработал инновационную модификацию стандартного анализа, используемого для идентификации последовательностей ДНК, связываемых классом белков — факторами транскрипции. В том эксперименте исследователи смешивают белок и хроматин, а затем используют антитела для выделения (иммунопреципитации) как интересующего белка, так и его предпочтительного сайта связывания.
Вместо антител Чу и Чанг использовали два или три химически меченых комплементарных нуклеотидных зонда для выделения регуляторных РНК после их связывания с ДНК. Однако этим методом удавалось захватить лишь около 10% регуляторной РНК. В конце концов, Чу пришла идея использовать десятки индивидуально меченых нуклеотидных последовательностей, связывающихся по всей молекуле.
«Проблема была в том, что РНК — длинная, гибкая молекула», — сказал Чанг. «Во время эксперимента она разрывалась на фрагменты, и химические метки терялись. Поэтому, поскольку мы не знали точно, какая часть lincRNA связывается с хроматином, мы создали серию меченых зондов, чтобы связаться с каждой её частью». Этот «плиточный» подход гарантирует, что даже если молекула РНК фрагментируется во время процедуры, исследователи всё равно смогут выделить небольшую часть, оставшуюся связанной с хроматином.
Используя новую технику, Чу и Чанг смогли исследовать специфичность связывания трёх lincRNA — одной из плодовой мушки и двух из млекопитающих. Они обнаружили, что одна из них, roX2, по-видимому, покрывает гены на единственной X-хромосоме у самцов и облегчает экспрессию генов.
«Мы показали, что roX2 очень точно связывается с X-хромосомой только в мужских клетках», — сказал Чанг, — «и делает это градиентом, связываясь всё больше и больше к транскрипционному концу гена. Похоже, это помогает элонгации и делает транскрипцию более эффективной, что важно, поскольку у самцов животных только одна копия X-хромосомы по сравнению с двумя у самок».
Другая lincRNA человека, компонент теломеразного комплекса TERC, занимает не только теломеры хромосом (защитные колпачки на концах), но и гены, вовлечённые в путь Wnt, который, как было показано, контролирует самообновление клеток.
«Это показывает интересную и прямую связь между механизмом репликации хромосом и самообновлением», — сказал Чанг. «Возможно, это помогает клетке отслеживать состояние своих теломер».
Наконец, HOTAIR, впервые идентифицированная в лаборатории Чанга, по-видимому, рекрутирует белковый комплекс, подавляющий гены (polycomb), для связывания с обширными участками ДНК.
«В совокупности наше исследование показывает, что наша методика широко применима и может значительно обогатить наше понимание того, как регуляторные РНК «отпирают» геном множеством очень специфических способов», — сказал Чанг. «Это очень захватывающе».