Новый метод визуализации мозга мармозеток
Исследователи из Института наук о мозге RIKEN в Японии разработали новую систему для визуализации активности отдельных нейронов в мозге мармозетки. Как сообщается в Cell Reports, исследование показывает, как усиление генетически закодированных флуоресцентных сигналов с помощью TET-индуцируемой экспрессии генов позволяет одновременно визуализировать сотни отдельных нейронов в мозге примата в течение нескольких месяцев.
Учёные, изучающие нейронную активность, связанную со сложным когнитивным и социальным поведением, имели ограниченный успех, используя двухфотонную микроскопию в мозге приматов. В рамках новой японской инициативы Brain/MINDS (Brain Mapping by Innovative Neurotechnologies for Disease Studies) исследователи под руководством Тэцуо Ямамори и Масанори Мацузаки использовали мармозетку — маленькую, но умную и социально сложную обезьяну — чтобы преодолеть прошлые ограничения.
«Простое применение той же техники, что и у мышей, не сработало, потому что флуоресцентный сигнал был слишком слабым, — объясняет ведущий автор Осаму Садаканэ. — Но, улучшив вирусную технику, мы усилили сигнал и смогли наблюдать большую группу нейронов в неокортексе мармозетки».
Двухфотонная микроскопия — это метод визуализации живых клеток путём возбуждения флуоресцентных соединений (флуорофоров) лазерами, излучающими инфракрасный свет. Когда флуорофоры одновременно поглощают два фотона, они испускают флуоресцентный сигнал. Поскольку нейроны используют кальций при передаче сигналов, нейронную активность можно визуализировать, генетически присоединив флуорофоры к кальциевым индикаторам — молекулам, связывающимся с кальцием. До сих пор использование этих генетически закодированных кальциевых индикаторов (GECIs) было успешным у мелких животных, таких как мыши, но ограничено у приматов из-за слабого уровня экспрессии, дававшего слишком тусклые сигналы.
Команда добилась успеха у мармозеток, модифицировав способ производства их выбранного GECI — GCaMP6f — в нейронах. Аденосвязанный вирус (AAV) часто используется в качестве вирусного вектора для экспериментального введения трансгенов или для генной терапии. Однако вместо простого введения его в нейроны мармозеток с помощью одного AAV команда использовала два AAV, усиливая экспрессию трансгена и связывая её с наличием/отсутствием соединения доксициклина, которое можно было добавлять в питьевую воду обезьян или убирать оттуда. Это позволило команде экспрессировать GCaMP6f в очень больших количествах, что резко повысило уровень флуоресценции и позволило легко визуализировать нейроны, что было невозможно без их инновации.
«Флуоресценцию было не только легко увидеть, — отмечает Садаканэ, — наша обратимая система экспрессии генов позволила нам визуализировать одни и те же нейроны в течение нескольких месяцев».
Обычно длительная экспрессия трансгенов AAV может повреждать нейроны, что затрудняет долгосрочные исследования визуализации. Убрав доксициклин из питьевой воды обезьян, команда смогла приостановить экспрессию GCaMP6f более чем на месяц и предотвратить повреждение нейронов. Затем они смогли повторно визуализировать те же самые нейроны после повторного введения доксициклина в воду.
Новый метод также позволил проводить визуализацию на субклеточном уровне — с обнаружением активности в аксонах и отдельных дендритах — и в корковых слоях на глубине до 400 микрон от поверхности мозга. Это позволило визуализировать отдельные нейроны в 3D, что критически важно для исследования организации корковых цепей.
«Следующий шаг — улучшить технику, чтобы её можно было использовать с бодрствующими, действующими мармозетками, — говорит руководитель группы Тэцуо Ямамори. — Тогда мы сможем соотнести нейронную активность с поведением и увидеть изменения в отдельных нейронах, происходящие в результате опыта.
В то время как многие используют двухфотонную микроскопию на мышах, они не могут изучать определённые сложные формы поведения, общие для приматов, включая нас. С нашим новым методом мы сможем исследовать, как работает мозг приматов, на уровне, ранее недоступном».