Гиалуронидаза

Гиалуронидаза — фермент из класса лиаз, который, действуя на β-1→4-связь, деполимеризует гиалуроновую кислоту. Внеклеточная гиалуронидаза продуцируется стафилококками, стрептококками, клостридиями и другими бактериями; может присутствовать в гное и экссудатах.

Для количественного определения гиалуронидазы первоначально находят рабочую дозу раствора гиалуроновой кислоты. Для этого к убывающим объёмам кислоты (0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 мл) добавляют нарастающие объёмы дистиллированной воды (0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 мл) так, чтобы в каждой пробирке общий объём смеси был равен 1 мл.

Порядок работы:

  1. Пробирки встряхивают и инкубируют при 37 °C в течение 15 минут.
  2. Затем переносят на 5 минут на лёд.
  3. В каждую пробирку добавляют по 2 капли 2 н. раствора уксусной кислоты.

За рабочую дозу принимают тот наименьший объём кислоты, в котором образуется чёткий сгусток.

Основной опыт также проводят в объёме 1 мл:

  • В 5 пробирок наливают объём гиалуроновой кислоты, соответствующий рабочей дозе.
  • К нему добавляют в убывающих количествах (0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 мл) 2-миллиардную взвесь суточной агаровой исследуемой культуры или разведённый в 10 раз субстрат.
  • Объём смеси в каждой пробирке доводят до 1 мл дистиллированной водой.
  • В 6-й пробирке готовят контроль: рабочая доза раствора гиалуроновой кислоты, доведённая до 1 мл водой.

Все пробирки встряхивают, помещают на 15 минут в термостат, переносят на 5 минут на лёд и добавляют в каждую по 2 капли уксусной кислоты. После осторожного перемешивания учитывают результат, начиная с контрольной пробирки. В ней должен быть ясно виден сгусток.

Интерпретация результатов:

  • Отсутствие сгустка в большем или меньшем числе опытных пробирок свидетельствует о присутствии в исследуемом материале гиалуронидазы и о степени её активности.
  • Появление сгустка во всех опытных пробирках указывает на отсутствие фермента.

Современный контекст

Согласно современной классификации ферментов (IUBMB, Международный союз биохимии и молекулярной биологии), гиалуронидазы (КФ 3.2.1.35) относятся не к лиазам, а к гидролазам, а именно к гликозидазам. Они расщепляют β-1,4-гликозидные связи в гиалуроновой кислоте, что соответствует механизму гидролиза, а не элиминирования (характерного для лиаз). Этот фермент играет ключевую роль в деградации внеклеточного матрикса, что важно для процессов ремоделирования тканей, эмбриогенеза, воспаления и метастазирования опухолей. Помимо бактериальных, существуют эукариотические гиалуронидазы (например, у млекопитающих), которые участвуют в контроле вязкости межклеточного вещества и клеточной миграции. Современные методы определения активности гиалуронидазы часто основаны на иммуноферментном анализе (ИФА), флуоресцентных или турбидиметрических подходах, которые являются более точными и менее трудоёмкими по сравнению с описанным методом образования сгустка.