Структуры мутантного белка-транспортера человека ABCG2, полученные методом криоэлектронной микроскопии

Белок-транспортер ABCG2 относится к семейству АТФ-связывающих кассет (ABC). Он экспрессируется в плазматических мембранах клеток различных тканей и барьеров, включая гематоэнцефалический, гематотестикулярный и плацентарный. Используя энергию АТФ, белок может транспортировать эндогенные субстраты, влиять на фармакокинетику многих лекарств и обеспечивать защиту от ксенобиотиков, включая противоопухолевые препараты, особенно при раке молочной железы. ABCG2 часто называют белком устойчивости рака молочной железы. Ранее были изучены его архитектура и структурные основы ингибирования малыми молекулами и антителами, однако механизм распознавания субстрата и АТФ-зависимого транспорта оставался неясным.

В новой статье, опубликованной в Nature, Иоаннис Маноларидис и коллеги представили высокодетальные крио-ЭМ структуры человеческого ABCG2 в двух состояниях: связанном с субстратом до транспорта и связанном с АТФ после транспорта. Для наблюдения обоих состояний учёные использовали мутантный белок, в котором каталитический глутамат был заменён на глутамин (ABCG2_EQ). Этот мутант показал сниженные скорости АТФазной и транспортной активности, что позволило «поймать» конформации, подходящие для структурных исследований. В субстрат-связанном состоянии в полости, обращённой к цитоплазме и расположенной примерно посередине мембраны, находилась одна молекула эстрон-3-сульфата (E₁S), использованная для функциональных исследований.

АТФ-индуцированные конформационные изменения вызвали жёсткие сдвиги трансмембранного домена, поворот нуклеотид-связывающих доменов (NBD) и изменения в ориентации их субдоменов. В своём механизме действия ABCG2 использует энергию связывания АТФ для выталкивания E₁S и других эндогенных субстратов. На основе размера и аффинности связывания соединений в исследовании удалось отличить субстраты от ингибиторов.

Авторы сначала установили, что замена каталитического глутамата E211 на глутамин в мотиве Уокера B приводит к мутантам с сильно сниженной (хотя и не отменённой) АТФазной и транспортной активностью в отношении E₁S. Для определения структуры, связанной с E₁S, к образцу добавили Fab-фрагмент моноклонального антитела 5D3, который связывался с внешней поверхностью ABCG2 и способствовал получению высокодетальной структуры. 5D3-Fab замедлял гидролиз АТФ и ингибировал транспортную активность ABCG2, реконструированного в липосомы, не влияя на взаимодействие ABCG2 с субстратом E₁S. Комплекс ABCG2_EQ показал конформацию, открытую внутрь, с общим разрешением 3.6 Å, что позволило чётко визуализировать трансмембранный домен и субстрат-связывающую полость.

В субстрат-связывающей полости мономеров ABCG2 авторы наблюдали особенность плотности, образованную трансмембранными (TM) спиралями TM2 и TM5a. Эта особенность могла связывать одну молекулу E₁S в двух ориентациях, но две молекулы E₁S не могли связываться одновременно из-за стерических препятствий их полициклических систем. Полость также могла связывать ингибиторы, демонстрируя свою двойную роль в связывании субстратов и множественных лекарств.

Учёные создали точечные мутации для ABCG2_EQ-E₁S, чтобы определить АТФазную активность и транспорт E₁S у полученных вариантов. Стабильность всех протестированных мутантов была схожа с нативным белком дикого типа, что позволило провести прямое сравнение. Например, мутант V546F имел нарушенную транспортную активность, но 12-кратное увеличение АТФазной активности, которая, однако, ингибировалась E₁S зависимым от концентрации образом. Этот результат показал, что введение двух фенильных колец в субстратную полость имитирует связывание субстрата для стимуляции АТФазной активности, но дальнейшее добавление E₁S «закупоривало» транспортер. Результаты для других мутантных вариантов варьировались, подчёркивая чувствительность связывающей полости к модификациям.

Дополнительные функциональные исследования с помощью крио-ЭМ показали, что связывание АТФ вызывает поворот α-спиральных доменов NBD на 35 градусов для их димеризации, что обеспечивает «силовой удар» в транспортном цикле. В каждом мономере ABCG2 индивидуальные интерфейсы трансмембранных и нуклеотид-связывающих доменов оставались в основном неизменными между состояниями без нуклеотида и с АТФ. Однако АТФ-индуцированные конформационные изменения вызывали сдвиги в NBD, заставляя цитоплазматические компоненты TMD сдвигаться друг к другу. Такие изменения играют важную роль в пути транслокации субстрата.

В АТФ-связанном состоянии ABCG2_EQ-E₁S фенильные кольца складывались друг против друга, схлопывая субстрат-связывающую полость и не оставляя места для связанного субстрата. Для транспорта через мембрану субстраты должны двигаться по пути транслокации в центре транспортера, чтобы достичь внешней полости до полного закрытия пути. Для этого должны происходить быстрые конформационные изменения, напоминающие перистальтику, чтобы создать пространство для субстрата.

Авторы предположили, что субстрат может связываться через цитоплазму или через «мембранный вход» в липидном бислое. После связывания димер NBD может закрыться только когда субстрат выйдет из субстрат-связывающей полости. В продуктивном транспортном цикле субстрат, как предполагается, движется по пути транслокации в центре транспортера через «лейциновую пробку». Как только субстрат покидает область пробки, структура АТФ-связанного ABCG2_EQ предполагает, что область пробки закрывается, и субстрат высвобождается наружу.

Одним из ограничений исследования было то, что мутация E211Q могла повлиять на энергетику задействованных конформационных изменений. Результаты позволяют предположить, что связывания АТФ может быть достаточно для шага экструзии субстрата, а транспортер может быть возвращён в конформацию, открытую внутрь, путём гидролиза АТФ. В отличие от других транспортеров, ABCG2, по-видимому, не формирует стабильную окклюдированную конформацию при связывании субстрата, а демонстрирует быстропреходящую конформацию с механизмами, напоминающими перистальтику, подобно бактериальному транспортеру BtuCD-F.

Ключевой нерешённый вопрос для полиспецифичных мультилекарственных транспортеров, таких как ABCG2, заключался в том, почему одни соединения действуют как субстраты, а другие — как мощные ингибиторы. Сравнив режимы связывания субстрата ABCG2 с двумя мощными ингибиторами, авторы обнаружили, что все три молекулы связываются в одной и той же полости транспортера. Исследование также показало, что когда субстрат E₁S и АТФ связываются с ABCG2 вместе, открытие пробки позволяет субстрату быть вытолкнутым во внешнюю полость. В отличие от этого, ингибиторы действуют как клинья, обездвиживая транспортер, фиксируя его структуру в конформации, открытой внутрь. Исследование предполагает, что размер и аффинность связывания соединений важны для транслокации в транспортерах, что позволяет отличать субстраты от ингибиторов. Работа даёт новое понимание для дальнейшего изучения динамики белка-транспортера ABCG2.