Чувствительность

Чувствительность — свойство организмов реагировать на абиогенные и биогенные факторы внешней среды, часто с нарушением структуры, функции или поведения. Чувствительность хозяина к паразитам обозначают термином «восприимчивость».

Чувствительность микроорганизмов к химиопрепаратам — свойство микроорганизмов реагировать на действие химиопрепаратов приостановкой размножения или гибелью.

Каждый вид или близкая группа видов имеют характерный спектр и уровень естественной (природной) чувствительности по отношению к определённому препарату или группе препаратов. В чувствительных популяциях в результате мутации, рекомбинации или иммиграции закономерно появляются особи с более узким спектром и более низким уровнем чувствительности, которые в селективных условиях среды могут стать доминирующими. Такие особи и популяции называются устойчивыми (см. Антибиотики).

С научной биолого-статистической точки зрения к чувствительным относят культуры, растущие на средах с концентрациями, не превышающими Х ± 2σ, и не растущие на средах, превышающих эту концентрацию. Культуры или популяции, рост которых не подавляется на средах с концентрацией препарата больше Х ± 2σ, относят к устойчивым.

В химиотерапии подход к определению чувствительности-устойчивости микроорганизмов иной, так как возможность создания концентрации химиопрепарата в крови и других тканях организма лимитируется рядом факторов, и прежде всего — токсическим или другим побочным действием препарата. Поэтому в качестве критерия чувствительности-устойчивости микроорганизмов к химиопрепаратам избирают их терапевтические концентрации в крови и других биотопах организма.

Мерой чувствительности микробов в указанном случае является минимальная ингибирующая концентрация (МИК) — минимальная концентрация препарата (мкг/мл), которая подавляет рост микробов на питательных средах в стандартных условиях постановки опыта.

Исходя из отношения между МИК и концентрацией препарата в крови при введении терапевтических доз, в клинической химиотерапии выделяют три категории чувствительности микробов (см. Методические указания, 1983, 1991):

Чувствительные — штаммы, рост которых подавляется концентрациями препарата, создаваемыми в сыворотке крови больного при назначении обычных терапевтических доз.
Умеренно-устойчивые — штаммы, подавляемые концентрациями, которые могут быть достигнуты при введении максимальных терапевтических доз препарата.
Устойчивые — штаммы, рост которых не подавляется концентрациями препарата, создающимися введением максимально допустимых доз.

Указанные категории предложены для испытания полуколичественным методом дисков. В методиках серийных разведений возможна количественная оценка чувствительности-устойчивости (МИК), которая сопоставляется с рекомендуемыми терапевтическими дозами.

Условия для получения достоверных результатов

Для получения достоверных результатов испытания на чувствительность микроорганизмов необходимо соблюдение ряда условий:

Испытывают в основном чистые культуры выделенных микробов. Смешанные культуры из-за неодинаковых темпов роста и межвидовой конкуренции часто дают искажённые результаты.
Из каждого материала проверяют чувствительность нескольких культур одного вида или их смесь. При системных моноэтиологичных заболеваниях и закрытых внебольничных процессах выборка может состоять из 2–3 культур. Открытые процессы, особенно вызванные условно-патогенными микробами, требуют большей выборки — 5–10 культур.
В связи с изменением состава популяции в процессе инфекции испытание на чувствительность необходимо повторять каждые 5–7 дней.
В случаях ассоциированной инфекции предпочтение отдают испытанию чувствительности у видов и вариантов, занимающих доминирующее и субдоминирующее положение в микробиоценозах.
Испытанию на чувствительность подлежат культуры, выделенные из первичного или вторичного микробного очага.

Методы определения чувствительности

В настоящее время для определения чувствительности микроорганизмов применяют три основных метода:

Диффузии препарата в агар из бумажных дисков (дискодиффузионный).
Серийных разведений в бульоне.
Серийных разведений в плотной питательной среде.

Определение чувствительности микроорганизмов к химиопрепаратам регламентировано рядом методических документов (например, приказ МЗ СССР № 250 от 13.03.1975 г., указания 1983 г., руководство 1991 г.).

Общие требования к материалам и средам

Диски: необходимы стандартные заводские диски из специальной бумаги. Кустарное производство даёт ненадёжные результаты.
Питательные среды: должны быть стандартными, обеспечивать оптимальные условия для роста микробов, не содержать ингибиторов роста и избыточного количества его стимуляторов, а также веществ, подавляющих противомикробное действие антибиотиков; иметь нейтральную или слабощелочную рН (7,0–7,4).
- Для бактерий, растущих на простых средах, используют бульон и 1,5–2 % агар Хоттингера, МПБ и 1,5–2 % МПА, среду АГВ.
- Для стрептококков и гемофильных бактерий применяют те же среды с добавлением дрожжевого гидролизата.
- Чувствительность дрожжей определяют на средах Сабуро, анаэробов — в специальных средах и анаэробных условиях.
- При определении чувствительности псевдомонад необходимо присутствие в среде ионов кальция и магния (оптимально — 50 мг/л Ca²⁺ и 25 мг/л Mg²⁺).

Дискодиффузионный метод

Ход исследования:

Исследуемую чистую культуру (из 5–10 колоний) выращивают 18–20 ч на МПА.
Готовят суспензию плотностью в 10 единиц оптического стандарта на физрастворе и разводят в 10 раз.
На поверхность плотной среды наливают 2 мл исследуемой культуры и покачиванием чашки равномерно распределяют её, остаток удаляют.
Среду подсушивают 20–30 мин при комнатной температуре.
Стерильным пинцетом на поверхность газона накладывают диски (не более 6 на чашку) на расстоянии 2 см друг от друга и от краёв чашки.
Инкубируют в термостате 24–48 ч при 37 °C (для метициллина и оксациллина — при 35 °C).

Учёт результатов:

Измеряют диаметр зоны задержки роста (с учётом диаметра диска). Результаты оценивают по таблицам, сравнивая диаметры зон с пограничными значениями, и относят штамм к одной из трёх категорий чувствительности.

Контроль качества: ВОЗ рекомендует параллельно включать в опыт тест-культуры: Escherichia coli ATCC 25292, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

Метод серийных разведений в бульоне

Основан на определении способности растворённого в питательном бульоне препарата вызывать гибель или ингибировать рост находящихся в нём микробов.

Ход исследования:

Из основных растворов антибиотиков готовят ряды серийных разведений (кратные 2) в объёме 1 мл.
Во все разведения каждого ряда добавляют по 1 мл исследуемой культуры.
Контроль содержит 1 мл культуры и 1 мл бульона.
Инкубируют при 37 °C до следующего дня.

Учёт результатов:

МИК соответствует концентрации препарата в последней пробирке с видимой задержкой роста. Для определения минимальной бактерицидной концентрации (МБК) делают высев из нескольких пробирок с задержкой роста на агар. МБК — это концентрация препарата в последней пробирке, высев из которой не дал роста.

Метод серийных разведений в плотной питательной среде

Базируется на способности растворённого в плотной питательной среде препарата ингибировать рост нанесённых на него микробов. Более производителен, чувствителен и точен, чем метод в жидкой среде, особенно при использовании штампа-репликатора.

Ход исследования:

В расплавленный и охлаждённый до 60 °C агар добавляют нужное разведение антибиотика (1/10 от объёма среды) и разливают по чашкам.
Посев проводят штампом-репликатором, смоченным в стандартизированной бульонной культуре.
Делают контрольный посев на среду без препарата.
Посевы инкубируют при 37 °C до появления роста на контроле.

Учёт результатов:

Культуру считают:

Чувствительной, если рост подавлен всеми тремя тестируемыми концентрациями.
Среднечувствительной, если рост подавлен двумя высшими концентрациями.
Умеренно устойчивой, если рост подавлен только высшей концентрацией.
Устойчивой, если рост наблюдается на всех трёх концентрациях.

Ускоренные и автоматизированные методы

Кроме классических методов, дающих ответ через 24–48 ч, существуют ускоренные (в том числе автоматизированные) методы определения чувствительности, позволяющие получить результат через 3–10 ч. Их достоверность в силу ряда причин может быть ниже, но это компенсируется скоростью получения ответа.

Современный контекст

Сегодня определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (антибиотикочувствительность) является краеугольным камнем клинической микробиологии и рациональной антибиотикотерапии. Актуальность проблемы многократно возросла в связи с глобальным распространением антибиотикорезистентности.

Современные стандарты: В настоящее время в России и мире используются обновлённые клинические рекомендации и стандарты (например, документы EUCAST — Европейского комитета по тестированию чувствительности к антимикробным препаратам, или CLSI в США), которые регулярно пересматриваются с учётом новых данных по резистентности и фармакокинетике препаратов.
Автоматизированные системы: Широко внедрены высокоточные автоматизированные системы для определения МИК (VITEK, Phoenix, MicroScan и др.), которые значительно ускоряют и стандартизируют процесс.
Молекулярные методы: Для быстрого выявления конкретных генов резистентности (например, mecA у MRSA, генов БЛРС) применяются методы ПЦР, что позволяет назначить таргетную терапию в течение нескольких часов.
Масс-спектрометрия: Технология MALDI-TOF MS, используемая для идентификации микробов,也开始 применяться для быстрой оценки механизмов резистентности, например, к карбапенемам.
Глобальный мониторинг: Созданы международные системы эпидемиологического надзора за антибиотикорезистентностью (GLASS, EARS-Net), что позволяет отслеживать её распространение и динамику в реальном времени.