Новый биосинтетический путь биологически активных стероидов в симбиотических грибах

Исследователи из Высшей школы фармацевтических наук Токийского университета и Института традиционной китайской медицины и природных соединений Цзинаньского университета идентифицировали кластер генов биосинтеза фураностероида деметоксивиридина и расшифровали его биосинтетический путь.

Фураностероиды, такие как вортманнин, виридин и деметоксивиридин, представляют собой особую группу высокоокисленных стероидов грибного происхождения с дополнительным фурановым кольцом. Они являются наномолярными ингибиторами фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K). Вортманнин, например, используется как коммерческий ингибитор PI3K в биологических исследованиях, а его полусинтетический аналог PX-866 проходил клинические испытания II фазы для лечения рака. Интересные структуры и высокая биологическая активность фураностероидов привели к активным попыткам их полного химического синтеза за последние 20 лет, и стереоселективный синтез вортманнина и (-)-виридина был наконец достигнут в 2017 году. Однако биосинтез этих важных молекул в грибах оставался плохо изученным.

Для идентификации кластера генов биосинтеза деметоксивиридина исследовательская группа секвенировала полный геном Nodulisporium sp. (симбиотического гриба, продуцирующего деметоксивиридин) и обнаружила в нем 103 гена цитохром P450 монооксигеназы. Кластеры генов CYP рассматривались как потенциальные мишени, поскольку деметоксивиридин имеет высокоокисленную структуру. Анализ локализации этих генов в геноме выявил двенадцать CYP-кластеров, содержащих два или более гена CYP.

Чтобы определить кандидатный кластер генов для деметоксивиридина, из каждого кластера случайным образом выбирали один ген CYP и анализировали его экспрессию с помощью ОТ-ПЦР в условиях продуктивного и непродуктивного синтеза деметоксивиридина. В результате нокаута кандидатных генов с помощью CRISPR-Cas9 группа идентифицировала кластер генов, ответственный за продукцию деметоксивиридина у этого симбиотического гриба. Последующие анализы с использованием гетерологичной системы экспрессии генов в Aspergillus oryzae и in vitro ферментативных тестов подтвердили каждый этап биосинтеза и позволили получить четырнадцать биосинтетических промежуточных соединений.

Анализ структура-активность промежуточных соединений показал, что 3-кетогруппа, C1β-OH и ароматическое кольцо C важны для ингибирования PI3K. Кроме того, in vitro исследования показали, что расщепление боковой цепи прегнана требует трех ферментов: флавинзависимой монооксигеназы Байера-Виллигера, эстеразы и дегидрогеназы. Это резко контрастирует с процессом в клетках млекопитающих, который опосредуется одним ферментом CYP. Обширные биоинформатические анализы показали, что этот путь расщепления боковой цепи прегнана широко распространен в грибных геномах и является консервативным путем метаболизма стеролов в царстве грибов.

Это исследование закладывает основу для раскрытия биосинтеза других фураностероидов и расширения химического разнообразия фармацевтически важных фураностероидов с помощью инженерного биосинтеза. Поскольку работа также установила платформу для генетических манипуляций с симбиотическими грибами, полученные знания откроют путь к изучению взаимодействия между растениями и симбиотическими грибами.