Автоматизация протокола для быстрого анализа экспрессии генов в больших масштабах

Молекулярные биологи строят одновременные профили экспрессии или активности тысяч генов, чтобы получить общую картину функции клетки. Экспрессия гена начинается с процесса транскрипции, во время которого последовательность ДНК, кодирующая ген, копируется в РНК.

На основе метода cap analysis of gene expression (CAGE) для идентификации и анализа сайтов начала транскрипции и их уровней экспрессии, исследовательская группа из Японии под руководством Масаёси Ито из RIKEN Omics Science Center разработала метод крупномасштабного анализа экспрессии генов. Он увеличивает продуктивность в восемь раз по сравнению с предыдущими методами.

Оригинальный протокол CAGE включает 17 шагов, в том числе процесс «захвата» концов исходных транскриптов, многочисленные экстракции с использованием органических растворителей и центрифугирование для создания библиотек комплементарной ДНК (кДНК). Ито и его коллеги упростили протокол и исключили этап ПЦР-амплификации, чтобы точнее отражать исходный профиль экспрессии. Подготовленные библиотеки состояли из миллионов молекул ДНК, каждая из которых соответствовала сайту начала транскрипции. Затем исследователи определили последовательность этих молекул кДНК и их количество с помощью одномолекулярного секвенатора HeliScope Genetic Analysis System.

Поскольку каждый шаг оригинального протокола выполнялся вручную, метод был трудоёмким, и подготовка 96 библиотек кДНК занимала примерно шесть недель. Сейчас у Ито и коллег установлены две новые автоматизированные системы, которые позволяют им генерировать 192 библиотеки кДНК каждые восемь дней. Автоматизация снижает стоимость секвенирования за счёт меньшего объёма ручной работы, и систему можно использовать с тремя наиболее распространёнными платформами для секвенирования ДНК.

Улучшение было достигнуто за счёт адаптации CAGE, при которой все шаги выполняются автоматической системой, состоящей из роботизированной манипуляторной руки, оснащённой 8-канальным устройством для работы с жидкостями. Протокол был дополнительно упрощён использованием магнитных частиц для очистки кДНК. Автоматизированный метод значительно быстрее оригинала и надёжно производит высокоточные последовательности. Поскольку постоянный контроль не требуется, две или более системы могут работать одновременно.

«В настоящее время мы разрабатываем систему автоматизации для платформы секвенирования следующего поколения Illumina HiSeq2000, — говорит Ито. — Это включает улучшение шагов, которые производят и захватывают кДНК сайтов начала транскрипции. Мы планируем внедрить новую систему подготовки библиотек в первой половине 2012 года».