Новый метод позволяет быстро анализировать кристаллическую структуру внутренне неупорядоченных белков
Внутренне неупорядоченные белки (IDPs) могут динамически менять свою конформацию в зависимости от внешней среды и, следовательно, связываться с различными соединениями. Однако их сложно анализировать. Исследователи из Tokyo Tech решили эту проблему с помощью нового подхода, который позволяет быстро анализировать кристаллическую структуру IDPs с помощью техники кристаллизации белков в бесклеточной системе.
В отличие от белков с фиксированной трёхмерной структурой, IDPs могут принимать множество различных конформаций. Эта гибкость делает их универсальными, но и трудными для изучения. Чтобы понять их биологические функции, важно определить факторы, стабилизирующие их субрегионы на атомном уровне. Один из подходов — иммобилизовать целевой IDP, связав его с белковым кристаллическим каркасом, что позволяет использовать методы белковой кристаллографии. Однако существующие методы для этого медленны и неудобны.
Команда под руководством профессора Такафуми Уэно разработала инновационный подход для быстрого анализа кристаллической структуры IDPs.
Ключевой элемент метода — использование бесклеточной кристаллизации белка (CFPC) для связывания целевого IDP с каркасным кристаллом. В качестве примера исследователи сосредоточились на фрагменте c-Myc — IDP из семейства генов, регулирующих клеточный цикл, апоптоз и другие функции.
Используя программное обеспечение для предсказания структуры белка Foldit, команда спроектировала кристалл полиэдрина (PhC), полученного из клеток насекомых, в качестве каркаса для связывания фрагментов c-Myc. Чтобы ускорить перекристаллизацию между PhC и фрагментами c-Myc, исследователи подготовили мРНК мономера PhC, слитого с c-Myc, и смешали её в системе, содержащей клеточные экстракты и строительные блоки PhC.
Поскольку клеточные экстракты содержат необходимый клеточный аппарат для транскрипции мРНК, эта система может производить большие количества PhC, слитых с c-Myc, без использования живых клеток. Это значительно ускоряет стабилизацию IDP и упрощает его последующее выделение для анализа.
После анализа кристаллизованных фрагментов c-Myc исследователи использовали молекулярно-динамическое моделирование, чтобы стратегически внести мутации в ген c-Myc, а затем повторили описанные шаги. Сравнивая, как модифицированные фрагменты связывались с каркасом PhC и какие структуры образовывались, команда смогла определить ключевые остатки, которые в конечном итоге управляют стабилизацией c-Myc.
«Эти результаты подчеркивают мощь нашего метода скрининга CFPC как ценного инструмента для определения структур сложных белков-мишеней и выяснения основных молекулярных взаимодействий, управляющих их стабильностью», — говорит Уэно.
Предложенная стратегия может быть чрезвычайно полезна в изучении биомолекулярного связывания, что является основополагающим аспектом в таких областях, как медицина и клеточная биология.
«Наша система скрининга будет применяться к целевым IDPs, партнеры по связыванию которых ещё не идентифицированы, и для разработки новых связывающих молекул, таких как ингибиторы», — говорит Уэно. — «Кроме того, быстрый скрининг кристаллических структур может позволить нам создать библиотеку дизайна белковых кристаллов, ускоряя выяснение механизмов сворачивания IDPs».