Первый полногеномный CRISPR-Cas9 скрининг в первичных клетках выявил новые регуляторы иммунного ответа
Исследователи из Broad Institute впервые применили технологию редактирования генома CRISPR-Cas9 для полногеномного скрининга в первичных клетках — клетках, взятых непосредственно из тканей млекопитающих, а не из иммортализованных клеточных линий.
Традиционные подходы к изучению биохимических цепей в клетке часто ограничены предшествующими знаниями, работая «под светом фонаря». Новый беспристрастный, полногеномный подход позволяет выявить компоненты, ранее остававшиеся «в тени».
Исследуемая система и метод
- Цель: Изучение клеточного пути Tlr4/LPS, критически важного для врожденного иммунного ответа на патогены.
- Механизм: Белки Tlr4 распознают липополисахариды (LPS) с поверхности бактериальных клеток и запускают выработку фактора некроза опухоли (TNF).
- Метод: Иммунные дендритные клетки, выделенные из специально созданной мышиной модели, экспрессирующей белок Cas9, инфицировали LPS. Затем с помощью направляющих РНК CRISPR проводили полногеномное нарушение работы генов. Клетки с аномально высоким или низким уровнем TNF изолировали и анализировали для выявления регуляторов пути.
Ключевые результаты
- Подтверждена роль многих известных регуляторов пути Tlr4/LPS.
- Обнаружены совершенно новые регуляторы, включая два белковых комплекса, ранее никогда не связывавшихся с этим путем, несмотря на более чем 20-летние интенсивные исследования.
- Многие из выявленных генов не имели ранее известной биологической функции и вряд ли были бы целенаправленно изучены в контексте этой системы.
Преимущества подхода
- Чувствительность: В отличие от скринингов на выживаемость клеток, новый метод позволяет количественно оценивать силу экспрессии гена по его выходному продукту (TNF). Это открывает возможность скрининга виртуально любого биологического процесса, для которого есть обнаруживаемый маркер.
- Обобщаемость: Использованная стратегия скрининга эффективна и может быть применена к множеству типов биологических исследований.
Технические аспекты
- Для анализа результатов скрининга, осложненных количественным характером данных, были разработаны новые вычислительные подходы.
- Мышиная модель, в которой все клетки организма экспрессируют Cas9, значительно упростила эксперимент, позволив вносить в клетки только направляющие РНК CRISPR.
Будущие направления
Хотя метод успешно идентифицировал важные для пути факторы, он не раскрывает их конкретный механизм действия в цепи. Команда проводит последующие исследования, чтобы понять, как эти компоненты работают.
Исследование опубликовано 30 июля в журнале Cell.