CRISPR-подход выявляет уязвимые места распространенного герпесвируса

Человеческий цитомегаловирус (HCMV) инфицирует около половины взрослого населения. Хотя обычно он протекает бессимптомно, вирус опасен для людей с ослабленным иммунитетом и нерожденных детей. Вероятность внутриутробного заражения составляет около 1 из 200, что может привести к проблемам с мозгом, легкими и ростом ребенка.

В новой статье, опубликованной 25 октября в Nature Biotechnology, Джонатан Вайссман и его коллеги применили передовые технологии CRISPR и секвенирования отдельных клеток к этому вирусу. Это дало наиболее детальную на сегодня картину того, как вирусные и человеческие гены взаимодействуют для создания инфекции HCMV, и выявило новые потенциальные способы остановить прогрессирование вируса путем манипуляции генами вируса и хозяина.

Исследование может стать важной дорожной картой для будущих исследований взаимодействий патогена и хозяина, а также помочь в разработке противовирусных препаратов. В ходе проекта исследователи составили список как вирусных, так и генов хозяина, которые либо были необходимы для репликации вируса, либо потенциально могли быть использованы для придания клетке-хозяину некоторого иммунитета. «Теперь у нас есть этот список — список потенциальных мишеней, против которых можно разрабатывать лекарства», — сказал Марко Хайн, первый автор исследования.

Понимание обеих сторон

Миллионы лет эволюции создали сложную сеть взаимодействий между вирусом и хозяином. Вирусы зависят от некоторых человеческих генов, называемых факторами хозяина. Захватывая эти факторы, вирусы проникают в клетки и реплицируют свой генетический материал.

Исследователи стремились получить более полное понимание сети взаимодействий вируса и хозяина на протяжении всей инфекции. Они выбрали HCMV в качестве объекта, потому что у вируса, как и у человека, двухцепочечная ДНК. Это означает, что технологии CRISPR, работающие путем разрезания ДНК, теоретически могут воздействовать и на вирус, и на хозяина.

Серия скринингов

Используя метод CRISPR-скрининга, исследователи сначала определили, какие именно области вирусного или человеческого генома влияют на судьбу инфицированных клеток-хозяев. Систематически «выключая» отдельные гены в большой популяции вирусов и клеток-хозяев, они могли оценить, насколько каждый ген важен для инфекции.

В 2016 году проект получил новое измерение с развитием доступного крупномасштабного секвенирования отдельных клеток. Идея заключалась в объединении CRISPR-скрининга, секвенирования отдельных клеток и метода скрининга PerturbSeq. Это позволило не просто измерять выживаемость клеток, но и наблюдать за паттернами экспрессии их генов с течением времени.

Комбинация этих методов дала огромный набор данных, который показал, какие гены важны и на каком этапе. «Секвенирование отдельных клеток позволяет нам наблюдать за этапами жизненного цикла вируса с гораздо более высокой точностью, а пертурбация позволяет понять, как факторы хозяина и вируса позволяют вирусу манипулировать хозяином и завершить свой жизненный цикл», — сказал Вайссман.

Полученные данные показали, как типичная траектория вируса — от начальных волн экспрессии вирусных генов до репликации полного вирусного генома и финального почкования новых вирионов — может быть нарушена путем изменения конкретных вирусных генов. Это также указало исследователям, от каких генов хозяина вирус зависит на разных этапах для «успешного» заражения.

«Ход инфекции запрограммирован в вирусном геноме, — сказал Хайн. — Если вы хотите вмешаться в ход инфекции, вы можете сделать это, нацелившись на вирусный фактор, или косвенно, нацелившись на фактор хозяина. И результаты концептуально различны. Если вы нацеливаетесь на вирусный фактор, вы срываете программу, которой вирус обычно следует. Если вы нацеливаетесь на фактор хозяина, сама программа не меняется, но вы меняете то, как далеко вирус продвигается в ее выполнении».

Эти результаты станут полезными инструментами для разработки препаратов, которые можно использовать в составе противовирусного «коктейля». Поскольку вирусы могут мутировать и адаптироваться, стандартный подход в противовирусной терапии предполагает комбинацию нескольких препаратов с разными мишенями. Это обеспечивает максимально полное уничтожение вирусов, снижая вероятность выживания и появления устойчивой популяции.

Список важных вирусных генов указывает на мишени HCMV для лекарственных коктейлей. Список вовлеченных человеческих генов может открыть путь для более косвенной терапии. «Если вы воздействуете на фактор хозяина, чтобы повлиять на вирус, вирусу гораздо труднее ускользнуть, потому что он не может просто мутировать так, чтобы препарат больше не связывался — ему пришлось бы мутировать, чтобы избавиться от зависимости от белка хозяина, что гораздо сложнее», — объяснил Хайн.

Конечно, у потенциального воздействия на человеческий ген или белок для лечения инфекции есть недостатки, и для создания жизнеспособного лечения этим путем потребуется гораздо больше работы. «Если вы нацеливаетесь на фактор хозяина, вы по определению нацеливаетесь на белок в нашем организме, выполняющий свою обычную работу, поэтому риск побочных эффектов намного выше», — отметил Хайн.

В будущем Хайн и Вайссман надеются применить свой многоуровневый подход к изучению инфекции к другим вирусам, таким как SARS-CoV-2. Хотя у коронавируса нет двухцепочечной ДНК, которую можно изменить с помощью CRISPR, исследователи все же могут изучить, какие гены хозяина важны на каждом этапе инфекции, и использовать свой подход, основанный на методах, чтобы получить неожиданные выводы о хорошо изученном вирусе.