Обзор клеточных РНК с высоты птичьего полета: новый метод идентифицирует рабочие копии генов в клетках человека

В биологии, как и в недвижимости, важна локализация. Рабочие копии активных генов — матричные РНК, или мРНК — стратегически расположены в живых тканях, и их местоположение часто помогает регулировать рост и развитие клеток и тканей. Однако для одновременного анализа многих мРНК ученым приходилось разрушать клетки, что не позволяло точно определить, где эти мРНК находились внутри клетки.

Теперь команда из Института биологически инспирированной инженерии Висса при Гарвардском университете и Гарвардской медицинской школы в сотрудничестве с Институтом Аллена по изучению мозга разработала новый метод, позволяющий ученым одновременно определять местоположение тысяч мРНК и других типов РНК в интактных клетках — при этом определяя последовательность «букв», или оснований, которые идентифицируют их и раскрывают их функцию.

Метод, названный флуоресцентной in situ РНК-секвенированием (FISSEQ), может привести к более ранней диагностике рака, выявляя молекулярные изменения, которые вызывают рак в казалось бы здоровой ткани. Он может отслеживать раковые мутации и их реакцию на современные таргетные терапии, а также выявлять мишени для более безопасных и эффективных методов лечения.

Метод также может помочь биологам понять, как ткани тонко изменяются во время эмбрионального развития, и даже помочь картировать лабиринт нейронов, которые формируют связи в человеческом мозге. Исследователи сообщили о методе в онлайн-выпуске журнала Science.

Фиксация РНК на месте

Здоровые клетки человека обычно активируют почти половину из своих 20 000 генов в любой момент времени, и они тщательно выбирают эти гены для получения желаемых клеточных ответов. Более того, клетки могут усиливать или ослаблять экспрессию генов, регулируя производство от нескольких рабочих копий гена до нескольких тысяч.

Исследователи сначала химически обработали ткань, чтобы зафиксировать тысячи РНК клетки на месте. Затем они использовали ферменты для копирования этих РНК в реплики ДНК и многократного копирования этих реплик для создания крошечного шара реплицированной ДНК, закрепленного в том же месте.

Им удалось зафиксировать и реплицировать тысячи РНК клетки одновременно, но затем они стали жертвами собственного успеха. РНК были так плотно упакованы внутри клетки, что даже усовершенствованный микроскоп и камера не могли отличить мигающие огоньки одного отдельного шара реплицированной ДНК от огоньков его соседей.

Новый способ визуализации РНК

Чтобы решить эту проблему, исследователи разработали нетрадиционный метод визуализации крошечных объектов внутри клеток. Он работает как городская почтовая система.

Исследователи поняли, что могут присвоить каждой РНК в клетке уникальный адрес: последовательность «букв», или оснований, в самой молекуле РНК. И они решили, что смогут прочитать этот адрес, используя методы, аналогичные секвенированию ДНК следующего поколения (next-generation DNA sequencing) — набору высокоскоростных методов секвенирования генома, в разработке которых Джордж Чёрч участвовал в начале 2000-х.

По аналогии ученые стремились зафиксировать РНК на месте в клетке, создать крошечный шар со множеством соответствующих ДНК-реплик для каждой РНК, а затем адаптировать секвенирование ДНК следующего поколения для работы в фиксированных клетках. Четыре мигающих цвета раскрыли бы последовательность оснований каждой реплики ДНК, что указало бы на последовательность оснований соответствующей исходной РНК. Эти последовательности теоретически предоставляли неограниченное количество уникальных адресов — по одному для каждой из исходных РНК.

Ученым удалось добиться успеха, выборочно активируя лишь небольшую часть этих мигающих точек в любой момент времени, что позволило им различать отдельные шары реплицированной ДНК, мигающие на клеточном ландшафте.

Однако эта стратегия работала бы только в том случае, если бы они могли прочитать достаточно последовательности оснований, чтобы обеспечить уникальный адрес. Сначала они не могли определить более шести оснований в реплике ДНК, что не давало достаточно уникальных адресов для идентификации отдельных генов в геноме человека.

FISSEQ в действии

Сначала был разработан алгоритм для сопоставления последовательности реплики ДНК с известной последовательностью генов в геноме человека. Мигающие огоньки, не соответствующие реальному гену, стирались с изображения.

Затем был модифицирован коммерческий набор для секвенирования ДНК, что позволило команде секвенировать 30 оснований — более чем достаточно, чтобы присвоить каждой реплике ДНК уникальный адрес. Таким образом команда смогла создать составное изображение, представляющее последовательность и местоположение РНК, соответствующих каждому гену в геноме человека.

Затем метод был протестирован для обнаружения генов, которые активируют клетки кожи при размножении и миграции для заживления смоделированной раны в чашке Петри. Клетки, растущие в рану, имели 12 генов, которые были активированы гораздо больше или меньше, чем у соседних клеток, бездействующих на периферии. Подобные эксперименты могут выявить новые маркеры больной ткани или новые мишени для таргетной молекулярной терапии.