Чувствительная методика учёта РНК в отдельных клетках предлагает мощный инструмент

Каждая клетка — это активный центр обмена сообщениями, где тысячи генов производят транскрипты матричной РНК (мРНК) для трансляции в функциональные белки. Соответственно, секвенирование мРНК отдельной клетки может дать ключевое представление о её состоянии и физиологии.

Однако точное количественное определение — серьёзная проблема, так как клетки содержат лишь крошечные количества мРНК, порядка десяти триллионных долей грамма. Команда под руководством Хироки Уэды и Ёхэя Сасагавы из Центра биологии развития RIKEN, внеся ключевые улучшения в существующие методы, разработала надёжный и воспроизводимый подход для анализа мРНК отдельных клеток.

Существует несколько методов полногеномного секвенирования (shotgun) для анализа РНК большого количества клеток. Эти технологии высокопроизводительного секвенирования, известные как RNA-Seq, можно адаптировать для масштаба одной клетки, используя ферментативный процесс — полимеразную цепную реакцию (ПЦР) — для амплификации малых количеств мРНК. Но даже самые эффективные методы остаются трудоёмкими и подверженными ошибкам. «Для одной клетки требуется несколько ПЦР, а также очистка для удаления нежелательных побочных продуктов», — объясняет Сасагава. Такая неэффективность приводит к несогласованным результатам, затрудняя различение значимых различий в экспрессии генов от экспериментальной ошибки.

Чтобы преодолеть эти ограничения, исследователи создали значительно улучшенную методику RNA-Seq для одной клетки с оптимизированными условиями реакции и ввели защитные механизмы для эффективной амплификации мРНК без генерации мешающих артефактов. Их метод «Quartz-Seq» позволил охарактеризовать общее содержание мРНК в отдельных эмбриональных стволовых клетках (ЭСК) с беспрецедентной воспроизводимостью между экспериментами.

Метод Quartz-Seq, как и другие методы RNA-Seq, легко отличал ЭСК от более зрелых в развитии клеток «примитивной энтодермы» на основе экспрессии генов. Однако Quartz-Seq также способен чётко измерять различия в экспрессии генов среди нескольких ЭСК на разных стадиях клеточного цикла. Исследователи могли даже уверенно различать истинные вариации генной активности среди внешне идентичных клеток, демонстрируя чувствительность метода. «Глобальная гетерогенность экспрессии генов может содержать важную биологическую информацию о судьбе клетки, условиях культивирования и реакции на лекарства», — говорит Сасагава. «Мы показали, что Quartz-Seq для одной клетки может обнаружить эту гетерогенность».

Метод Quartz-Seq уже доказал свою ценность для изучения генетических различий между отдельными клетками. В будущем Уэда и Сасагава надеются ещё больше упростить Quartz-Seq и расширить свою методику для обнаружения других классов РНК.