Суперразрешающая микроскопия показывает детали структуры биоплёнок и возможные мишени для лекарств

Новый метод визуализации, разработанный в Калифорнийском университете в Беркли, выявил возможную стратегию борьбы со многими бактериальными заболеваниями, такими как холера, лёгочные инфекции у пациентов с муковисцидозом и даже хронический синусит. Эти инфекции образуют биоплёнки, делающие их устойчивыми к антибиотикам.

Используя новую стратегию флуоресцентного мечения и суперразрешающую световую микроскопию, исследователи смогли изучить структуру липких бляшек — бактериальных биоплёнок, которые делают эти инфекции столь устойчивыми. Они также определили генетические мишени для потенциальных препаратов, которые могли бы разрушить бактериальное сообщество и сделать бактерии уязвимыми для антибиотиков.

«В конечном итоге мы хотим оставить этих микробов без дома», — заявил ведущий исследователь Вейсель Берк, постдок кафедры физики и Калифорнийского института количественных бионаук (QB3).

Берк и его соавторы, включая нобелевского лауреата Стивена Чу, сообщают о своих результатах в выпуске журнала Science от 13 июля.

«В своей естественной среде обитания 99,9% всех бактерий живут сообществами и прикрепляются к поверхностям в виде биоплёнок; согласно Национальным институтам здоровья (NIH), 80% всех инфекций у человека связаны с биоплёнками», — сказал Берк.

Исследователи смогли применить новые методы, позволившие получить «уличный» вид этих биоплёнок, где они узнали, «как они растут из одной клетки и объединяются, образуя комнаты и целые здания». «Теперь мы можем предложить логичный подход к тому, как разрушить их здание или предотвратить его формирование».

Сочетая суперразрешающую микроскопию с техникой, разработанной Берком (которая позволяет непрерывно метить растущие и делящиеся клетки в культуре), биологи смогут записывать покадровое видео того, «как бактерии строят свои замки».

Бактерии — не одиночки

Популярный взгляд на бактерии как на свободноживущие организмы, легко контролируемые антибиотиками, устарел. Учёные теперь понимают, что бактерии проводят большую часть жизни в колониях или биоплёнках, даже в теле человека. В то время как одиночные бактерии могут быть чувствительны к антибиотикам, плёнки могут быть устойчивее в 1000 раз, и большинство из них можно удалить только хирургическим путём.

Имплантаты, такие как кардиостимуляторы, стенты и искусственные суставы, иногда инфицируются бактериями, образующими биоплёнки. Эти очаги периодически выделяют бактерий («первопроходцев», как их называет Берк), которые могут вызывать острые инфекции и лихорадку. Антибиотики могут уничтожить свободно плавающих бактерий и временно подавить инфекцию, но биоплёнка остаётся нетронутой. Единственное постоянное решение — удаление устройства, покрытого биоплёнкой, и замена его новым стерильным имплантатом.

Постоянная бактериальная биоплёнка в пазухах может вызывать иммунный ответ, приводящий к хроническим синусовым инфекциям. Пока наиболее эффективное лечение — хирургическое удаление поражённой ткани.

Бактерии также образуют постоянные, пожизненные биоплёнки в заполненных слизью лёгких пациентов с муковисцидозом и ответственны за хронические лёгочные инфекции, ведущие к ранней смерти. Хотя длительная антибиотикотерапия помогает, она не может полностью искоренить инфекцию.

Исследование структуры биоплёнки

Для изучения биоплёнки, образованной бактериями холеры, Берк собрал собственный суперразрешающий микроскоп в подвале Стэнли-холла. Он разработал новую технику, названную непрерывным иммуноокрашиванием, которая позволила ему отслеживать четыре отдельные молекулы-мишени с помощью четырёх отдельных флуоресцентных красителей.

Он обнаружил, что в течение примерно шести часов одиночная бактерия выделяет белковый «клей», чтобы прикрепиться к поверхности, затем делится на дочерние клетки, выделяя белок, который «цементирует» дочерние клетки друг с другом. Дочерние клетки продолжали делиться, пока не образовывали кластер (подобно кирпичному зданию с раствором), после чего бактерии выделяли белок, который вместе с молекулами сахара окружал кластер, как оболочка здания.

Кластеры разделены микро-каналами, которые, возможно, позволяют питательным веществам поступать внутрь, а отходам — выходить.

«Если мы сможем найти лекарство, чтобы избавиться от белка-«клея», мы сможем удалить всё здание целиком. Или если мы избавимся от белка-«цемента», мы сможем растворить всё и обрушить здание, обеспечив доступ антибиотиков», — сказал Берк. «Это могут быть мишени для специфических антибактериальных лекарств будущего».

Суперразрешающая микроскопия: рисование светом

Берк — биолог, обученный физике и оптике, с опытом визуализации структур белков. Он подозревал, что мощная новая суперразрешающая световая микроскопия может раскрыть неизвестную структуру биоплёнок. Суперразрешающая микроскопия обеспечивает разрешение в 10 раз лучше, чем стандартная световая микроскопия (20 вместо 200 нанометров), подсвечивая только часть изображения за раз с помощью фото-переключаемых зондов и компилируя тысячи изображений в один снимок. Процесс похож на рисование светом.

Проблема заключалась в том, как метить клетки флуоресцентными красителями для непрерывного наблюдения за их ростом и делением. Классический подход — сначала окрашивание, затем отмывка, затем получение лишь одного снимка. Берк нашёл способ проводить окрашивание, сохраняя все флуоресцентные зонды в растворе во время визуализации, что позволило непрерывно наблюдать за всем процессом, начиная с одной клетки и заканчивая зрелой биоплёнкой.

«Это была очень простая, крутая идея, но все думали, что это безумие», — сказал он. «Да, это было безумие, но это сработало».