Move over CRISPR, the retrons are coming

Исследователи из Института Висса и Гарвардской медицинской школы создали новый инструмент для редактирования генов — Retron Library Recombineering (RLR). В отличие от CRISPR-Cas9, который разрезает ДНК и может быть токсичен для клеток, RLR эффективно создаёт мутации, не повреждая двойную цепь ДНК.

Суть метода

RLR использует ретроны — сегменты бактериальной ДНК, которые производят фрагменты одноцепочечной ДНК (ssDNA) внутри клетки. Эти фрагменты, содержащие нужную мутацию, с помощью белка SSAP встраиваются в геном дочерних клеток во время репликации.

Ключевые доработки системы для работы в E. coli:

  • Инактивация системы репарации неспаренных оснований, которая "исправляла" вносимые мутации.
  • Отключение двух генов экзонуклеаз, разрушающих свободную ssDNA. Эти изменения повысили эффективность внедрения мутации с менее 0.1% до более 90% популяции.

Преимущества RLR

  1. Мультиплексирование и "штрихкодирование": Каждый ретрон имеет уникальную последовательность, которая служит меткой (штрихкодом) для мутантной клетки. Это позволяет одновременно создавать и анализировать миллионы мутаций в смешанной популяции, секвенируя только короткий "штрихкод", а не весь геном.
  2. Простота библиотек: Для создания библиотеки из десятков миллионов последовательностей нужен только ретрон-плазмид, тогда как для CRISPR требуется синтез и направляющей РНК, и донорской ДНК для каждой мутации.
  3. Нетоксичность: RLR не создаёт разрывов ДНК, что устраняет проблему токсичности CRISPR.
  4. Накопление мутаций: Доля клеток с нужной мутацией увеличивается со временем по мере репликации, в отличие от "одноразового" подхода CRISPR.

Экспериментальное подтверждение

RLR успешно использовали для:

  • Детекции известных мутаций устойчивости к антибиотикам.
  • Измерения небольших различий в устойчивости от сходных мутаций.
  • Скрининга библиотеки, созданной из случайно нарезанных фрагментов генома устойчивого штамма E. coli, и последующего выявления обогащённых ретронных последовательностей, дающих устойчивость.

Перспективы

RLR открывает путь к масштабным исследованиям взаимодействий множества мутаций в геноме и генерации больших данных для прогнозирования эффектов мутаций с помощью машинного обучения. Метод может быть использован самостоятельно или в комбинации с CRISPR для улучшения редактирования в системах, где CRISPR токсичен.