Раскрыт механизм циклизации синтазы циклического β-1,2-глюкана

Циклические β-1,2-глюканы (CβGs), состоящие из повторяющихся звеньев глюкозы, связанных β-1,2-гликозидными связями, играют роль в бактериальных инфекциях и симбиотических отношениях. Их биосинтез катализирует фермент циклическая β-1,2-глюкан синтаза (CGS), осуществляющий замыкание линейного β-1,2-глюкана (LβG) в кольцо.

Хотя метод крупномасштабного ферментативного синтеза LβG уже установлен, его комбинация с CGS для эффективного одностадийного получения CβGs затруднена из-за слабой циклизирующей активности и низкой стабильности фермента.

Известно, что связывание глюкозы, удлинение цепи LβG, подгонка длины цепи и циклизация распределены по трём различным доменам CGS. Однако детальный механизм работы домена циклизации оставался неизвестным.

Группа японских исследователей раскрыла каталитический механизм циклизации, проведя функциональный и структурный анализ домена циклизации CGS из бактерии Thermoanaerobacter italicus (TiCGSCy). Результаты опубликованы в журнале Applied Microbiology and Biotechnology.

Ключевые этапы исследования:

  1. Экспрессия домена TiCGSCy в E. coli.
  2. Анализ продуктов реакции с LβG в качестве субстрата показал, что TiCGSCy продуцирует CβGs, устойчивые к β-глюкозидазе.
  3. Обработка TiCGSCy β-1,2-глюкоолигосахаридами (2–10 единиц глюкозы) выявила, что механизм:
    • Не включает реакцию гидролиза.
    • Осуществляет трансгликозилирование.
    • Требует субстраты длиной не менее гексасахарида (≥6 единиц глюкозы).
    • Сохраняет аномерную конфигурацию (аномер-сохраняющий механизм).

Структурный анализ и механизм:

Рентгеноструктурный анализ показал структурное сходство TiCGSCy с β-1,2-глюканазами Chitinophaga pinensis (CpSGL, семейство GH144) и Talaromyces funiculosus (TfSGL, семейство GH162), несмотря на низкую гомологию аминокислотных последовательностей.

Сравнение структур позволило идентифицировать каталитические остатки TiCGSCy:

  • E1356 — выступает в роли общей кислоты/основания.
  • E1442 — выступает в роли нуклеофила.

Детальный механизм реакции TiCGSCy:

  1. E1356 (кислота) отдаёт протон атому кислорода гликозидной связи через 3-OH группу глюкозы в субсайте +2. Одновременно E1442 (нуклеофил) атакует аномерный центр в субсайте –1, образуя гликозил-ферментный промежуточный продукт.
  2. E1356 (основание) забирает протон от 2-OH группы глюкозы в субсайте +1 через 3-OH группу глюкозы в субсайте +2.
  3. Активированная 2-OH группа в субсайте +1 атакует аномерный углерод в субсайте –1, высвобождая продукт трансгликозилирования.

Если атакующая гидроксильная группа принадлежит той же молекуле, что образует промежуточный продукт, формируется циклический продукт. Если группа принадлежит другой молекуле — образуется линейный продукт.

Значение работы:

Благодаря своему неканоническому механизму, CGS определяет новое семейство гликозидгидролаз — GH189. Идентификация остатков, важных для циклизирующей активности, открывает путь к поиску более активных и стабильных ферментов, а также к исследованиям в области ингибирования CGS.