Метод коррекции ошибок позволяет точно измерить транскриптом в единичных клетках

Ученые из Медицинского института Говарда Хьюза (HHMI) разработали метод визуализации молекул РНК внутри клеток, позволяющий одновременно определять идентичность, местоположение и количество более 1000 различных видов РНК. Разработчики утверждают, что метод можно масштабировать для визуализации и идентификации десятков тысяч видов РНК в одной клетке.

Метод, названный мультиплексной устойчивой к ошибкам флуоресцентной гибридизацией in situ (MERFISH), описан в статье, опубликованной 9 апреля 2015 года в Science Express. Технология использует комбинаторное мечение, последовательную визуализацию и устойчивые к ошибкам схемы кодирования для идентификации множества видов РНК. В конкретной реализации авторы использовали десятки тысяч олигонуклеотидных зондов, связывающихся с клеточными РНК, чтобы закодировать каждый вид РНК уникальной комбинацией последовательностей для считывания, а затем использовали флуоресцентно меченные зонды для их обнаружения в течение 14 или 16 раундов гибридизации. Уникальные комбинации зондов связываются с отдельными молекулами РНК, формируя 14-битный или 16-битный код, идентифицирующий каждую из них.

"Мы считаем, что наш подход настолько надежен, что его можно масштабировать до всего транскриптома [полного набора РНК клетки]", — говорит Сяовэй Чжуан, исследователь HHMI в Гарвардском университете, руководившая разработкой.

Ядро транскрипционного аппарата — РНК-полимераза — копирует информацию с генов ДНК на молекулы матричной РНК (мРНК), которые затем управляют производством белков. Измерение количества РНК обычно указывает на относительную активность конкретных генов. Дополнительную информацию можно получить, определив местоположение конкретных молекул РНК внутри клетки или ткани, поскольку оно влияет на то, где закодированный белок будет выполнять свою функцию.

Метод флуоресцентной гибридизации in situ на уровне одной молекулы (smFISH), разработанный биологом Робертом Сингером, ценен для визуализации РНК в их естественной среде. Используя флуоресцентные ДНК- или РНК-зонды для обнаружения специфических последовательностей, метод позволяет количественно определять и локализовать конкретные молекулы РНК. Комбинируя несколько зондов для каждой РНК, с его помощью можно одновременно визуализировать до ~30 различных молекул РНК в отдельных клетках.

"smFISH внес огромный вклад в понимание клеточной биологии", — говорит Чжуан.

Однако Чжуан задалась целью отличить не 30, а все ~20 000 белково-кодирующих РНК в одной клетке или даже все ~60 000 РНК (включая некодирующие). Проблема заключалась в невозможности визуализировать и различить десятки тысяч флуоресцентных зондов на одном изображении или проводить десятки тысяч раундов визуализации по очереди.

Решение пришло с идеей последовательной визуализации с комбинаторным мечением, позволяющей связать с каждой РНК практически неограниченное количество паттернов зондов. Чжуан и ее команда разработали специальные двоичные коды для кодирования отдельных РНК, а также схемы мечения и визуализации для их декодирования.

Принцип работы MERFISH:

1. К молекулам РНК в клетках присоединяются "кодирующие зонды", которые специфично связываются с целевыми РНК и кодируют их комбинацией последовательности для считывания.
2. Затем в последовательных раундах к клеткам добавляются флуоресцентно меченные "считывающие зонды".
3. После добавления каждого считывающего зонда делается снимок. РНК, которые флуоресцируют на данном шаге, получают в своем двоичном коде 1, остальные — 0.
4. После 16 раундов каждая РНК получает уникальную 16-битную строку из 1 и 0, которая ее идентифицирует.

Проблема ошибок и стратегия коррекции:

Основная проблема — каждый раунд визуализации introduces возможность ошибки. В коде из 16 бит, использующем все ~60 000 возможных комбинаций, даже одна ошибка полностью превращает одну РНК в другую, что приводит к катастрофическому накоплению ошибок.

Для решения этой проблемы команда заимствовала стратегию коррекции ошибок из области цифровой связи. Вместо использования всех возможных кодов они применяют только коды, которые отличаются от всех других более чем на один бит.

"Чтобы преобразовать одно допустимое кодовое слово в другое, нужно одновременно совершить несколько ошибок в одной РНК. Это гораздо сложнее", — объясняет Чжуан.

Использование кодов, отличающихся на два и более бита, даже позволяет исправлять ошибки. Это ограничивает количество различных РНК, которые можно идентифицировать, но dramatically повышает точность.

"Мы визуализируем меньше РНК, используя эти устойчивые к ошибкам коды, но этот компромисс того стоит", — говорит Чжуан.

Роберт Сингер назвал подход Чжуан концептуальным прорывом, который обходит ограничения на количество флуоресцентных меток, различимых как дискретные цвета, применяя теорию информации.

Результаты и перспективы:

Команда Чжуан использовала MERFISH со схемой кодирования, способной обнаруживать и исправлять ошибки, для одновременной визуализации 140 видов РНК в отдельных человеческих клетках. Результаты по количеству копий каждой молекулы closely совпали с результатами традиционных измерений smFISH для отдельных генов и, в усреднении по сотням клеток, с результатами полногеномного секвенирования РНК (RNA-seq).

Используя альтернативную схему, которая только обнаруживает, но не исправляет ошибки, они визуализировали набор из 1001 вида РНК. Обе схемы можно масштабировать для визуализации большего количества видов РНК, но схемы с коррекцией ошибок более предпочтительны для измерений в масштабе всего транскриптома из-за их лучшей масштабируемости по ошибкам.

Новый метод позволяет решать множество биологических вопросов:

• Изучая вариацию количества РНК от клетки к клетке, команда обнаружила паттерны, предполагающие группы совместно регулируемых генов, и предложила потенциальные функции для около 100 генов с неизвестной функцией.
• Были наблюдены интересные субклеточные пространственные паттерны распределения РНК.
• Метод позволяет исследовать экспрессию генов в отдельных клетках без их извлечения из ткани, что особенно ценно для таких тканей, как мозг, где сложно структурированные клетки трудно отделить друг от друга.