Метод секвенирования раскрывает мир вирусных мутаций
Исследователи из A*STAR разработали метод секвенирования, который позволяет отслеживать конкретные варианты вирусов, образующиеся при быстрой мутации таких вирусов, как гепатит B, внутри отдельных пациентов. Этот прорыв дает беспрецедентное представление об эволюционирующей структуре популяции вирусов и может помочь в создании новых лекарств, предотвращающих развитие штаммов, устойчивых к препаратам и иммунным ответам.
Вирусы мутируют за счет небольших изменений в каждом геноме, что приводит к появлению вариантов с однонуклеотидными заменами (SNV). Наборы SNV, возникающих на одном вирусном геноме, называются гаплотипами. Эти мутации варьируются от одного хозяина к другому, создавая копии вирусного генома, которые немного отличаются друг от друга. Ученые полагают, что мутировавшие геномы играют роль в репликации вируса.
«Глубокое секвенирование ДНК произвело революцию в изучении эволюции вирусов, — заявляет Уильям Буркхолдер, руководивший командой из Института молекулярной и клеточной биологии A*STAR вместе с учеными из Сингапура, Великобритании и США. — Однако оно недостаточно чувствительно, чтобы обнаруживать редкие SNV, находить совместно встречающиеся мутации на одном геноме или организовывать мутации в отдельные генетические группы внутри вирусной популяции. Наша методика призвана решить эти проблемы».
Команда усовершенствовала существующие методы глубокого секвенирования, создав так называемую сборку, направляемую штрих-кодами, для сверхдлинных последовательностей (BAsE-Seq), используя недорогой секвенатор коротких чтений. Система с помощью штрих-кодов точно определяет, какие мутации относятся к какому вирусному геному, и может помочь идентифицировать длинные вирусные гаплотипы с повышенной точностью и чувствительностью.
«Хитрость заключается в том, чтобы генерировать короткие фрагменты ДНК из длинных матриц ДНК, отслеживая при этом происхождение каждого фрагмента, — объясняет Буркхолдер. — Для этого мы присвоили каждому фрагменту штрих-код с «адресом» его исходной молекулы. Это означало, что мы могли восстановить полную последовательность ДНК после того, как находили мутации на каждом фрагменте».
Анализ клинического образца вируса гепатита B с помощью BAsE-Seq позволил команде получить более 9000 вирусных гаплотипов, что дало беспрецедентное представление об общей структуре популяции вируса. На основе этих данных исследователи создали филогенетическое дерево, иллюстрирующее разнообразие вируса в образце пациента. Им успешно удалось идентифицировать уникальные гаплотипы, встречающиеся с частотой 0,4% и выше у каждого пациента.
«BAsE-Seq — это мощный и экономичный подход для изучения популяционной динамики ДНК-вирусов, — заявляет Буркхолдер. — В будущем мы расширим применение этой методики для других вирусных исследований».