Генерация противогрибковых средств с помощью бактериальной конъюгации к дрожжам
Дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), критически важны в промышленности, но некоторые виды грибов являются патогенами. Разработка противогрибковых препаратов требует новых методов доставки генетического материала в клетки грибов.
Плазмиды — небольшие генетические структуры — можно использовать для доставки генов. Хотя конъюгация (перенос плазмид между бактериями) эффективна для создания антимикробных агентов, её применение для дрожжей оставалось сложной задачей.
Команда исследователей из Канады оптимизировала перенос конъюгативных плазмид от бактерий к различным видам дрожжей.
«Для создания наших новых плазмид мы создали производные от конъюгативной плазмиды pTA-Mob 2.0, используя направленные делеции генов и кластерные мутации, чтобы улучшить бактериальную конъюгацию с дрожжами», — пояснил доктор Богумил Дж. Карас, ведущий автор исследования, опубликованного в BioDesign Research.
Исходную плазмиду pTA-Mob 2.0 оптимизировали, удалив 55 генов или небольших регионов, создав четыре упрощённые плазмиды: M1–M4. Их переносили из бактерии Escherichia coli (E. coli) в S. cerevisiae.
Плазмида M3, клон 1 (M3C1), показала наибольшее увеличение эффективности конъюгации. Ключевой оказалась мутация в промоторной области конъюгативного гена traJ, которая снизила его экспрессию и повлияла на другие конъюгативные белки, способствуя переносу.
На основе M3C1 создали пять производных плазмид, включая pSuperCon5 (pSC5), с дополнительными элементами для улучшенного переноса к разным видам дрожжей и диатомовым водорослям, а также с маркерами антибиотикорезистентности.
По сравнению с исходной pTA-Mob 2.0, частота бактериально-дрожжевой конъюгации для pSC5 была выше в 10 раз (в cis-конфигурации, когда плазмида мобилизует сама себя) и в 23 раза (в trans-конфигурации, когда она мобилизует другую плазмиду). Это может быть связано с меньшим негативным воздействием бактерий-доноров, несущих pSC5, на дрожжи.
Усиленную конъюгацию также воспроизвели с другим видом бактерий-доноров — Sinorhizobium meliloti. Плазмида pSC5 позволила успешно перенести ДНК в семь видов дрожжей, включая патоген Candida auris, хотя и с разной эффективностью.
Плазмиду pSC5 адаптировали для Golden Gate Assembly — метода молекулярного клонирования. Исследователи подтвердили, что их усовершенствованный метод конъюгации и плазмиды можно с высокой эффективностью использовать для доставки противогрибковых терапий.
Теперь команда рассматривает интеграцию своей межцарственной системы конъюгации с CRISPR-платформами для редактирования генов патогенных грибов в различных средах.
«Конъюгационные методы, подобные разработанному нами, предоставляют уникальный и функциональный способ доставки плазмид между видами микроорганизмов in vitro и in vivo. При дальнейшем повышении частоты конъюгации наши сконструированные конъюгативные плазмиды могут быть использованы в качестве противогрибковых реагентов для создания антимикробных препаратов следующего поколения», — отметил доктор Карас.