Новые наноскопические инструменты для изучения связывания лигандов рецепторами и количественного определения двух сайтов связывания

Сигнальные процессы в организмах регулируются специфическими внеклеточными и внутриклеточными взаимодействиями с участием сотен различных, функционально универсальных рецепторов в клеточных мембранах. Ситуацию для учёных усложняет не только неравномерное распределение рецепторов и их способность связывать более одного лиганда, но и то, что рецепторы одного типа могут связывать лиганд сильно, слабо или не связывать вовсе. Требуются новые методы для точного количественного анализа таких сложных взаимодействий.

Международная команда учёных, включая Роберта Тампе и Ральфа Винеке из Университета Гёте во Франкфурте, разработала новый высокоразрешающий метод, который впервые позволяет точно идентифицировать и количественно оценивать взаимодействия рецептора с двумя лигандами одновременно. Метод опубликован в последнем выпуске журнала Nature Communications.

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) — мощный метод наноразмерной характеризации поверхностей, использующий кантилевер с очень тонким остриём. АСМ на основе кривых зависимости силы от расстояния (FD-based AFM) сочетает высокоразрешающую визуализацию и силовую спектроскопию одиночных молекул. В исследованиях биологических образцов остриё АСМ приближается и отдаляется от образца для каждого пикселя. Методы FD-based AFM используют различные покрытия острия АСМ как инструментарий и добились впечатляющего прогресса в последние годы. Для детекции специфических сайтов связывания FD-based AFM требует прикрепления лиганда к острию АСМ. При сканировании белковых комплексов в мембране такие функционализированные острия могут измерять взаимодействия прикреплённого лиганда с белком. Ранее не удавалось одновременно визуализировать одиночные мембранные рецепторы и детектировать их взаимодействия более чем с одним лигандом, но новый метод преодолел это препятствие.

В качестве доказательства концепции учёные использовали человеческий рецептор, активируемый протеазой 1 (PAR1), принадлежащий к большому семейству G-белок-сопряжённых мембранных рецепторов (GPCR). GPCR опосредуют большинство клеточных реакций на гормоны и нейротрансмиттеры, а также отвечают за зрение, обоняние и вкус. GPCR могут сосуществовать в разных функциональных состояниях в клеточной мембране и связывать различные лиганды с разной силой или аффинностью. GPCR PAR1 активируется коагуляционной протеазой тромбином, что запускает сигнальные каскады для инициации клеточных ответов, участвующих в гемостазе, тромбозе, воспалении и, возможно, восстановлении тканей. С помощью нового метода FD-based AFM удалось визуализировать человеческий PAR1 в протеолипосомах, одновременно детектируя внеклеточные и внутриклеточные взаимодействия PAR1 с двумя лигандами. Разработанные поверхностная химия и наноскопический метод применимы к широкому спектру биологических систем in vitro и in vivo.