Визуализация и оценка поглощения холестерина, опосредованного NPC1L1, на уровне эндоцитарных везикул

Избыточное поглощение холестерина из просвета кишечника способствует развитию гиперхолестеринемии — установленного фактора риска атеросклеротических сердечно-сосудистых заболеваний. Поглощение кишечного холестерина в основном опосредуется белком Niemann-Pick C1-like 1 (NPC1L1), который ответственен примерно за 70% абсорбции. Мыши с дефицитом NPC1L1 устойчивы к диет-индуцированной гиперхолестеринемии, что указывает на стратегию лечения, связанную с ингибированием экспрессии или активности NPC1L1.

Белок NPC1L1 экспрессируется в щеточной каемке тонкого кишечника. Он сильно N-гликозилирован и состоит из 1332 аминокислот с 13 трансмембранными сегментами, что затрудняет создание идеального антитела для анализа его поведения in vivo. На основе исследований на клеточных линиях in vitro предполагается, что NPC1L1 опосредует поглощение холестерина через клатрин-зависимый эндоцитоз. Однако у этой модели есть нерешенные вопросы. Фактически, эндоцитарные везикулы NPC1L1 с холестерином не были продемонстрированы в физиологических условиях из-за отсутствия инструментов для визуализации этого процесса in vivo.

С помощью технологии редактирования генов CRISPR/Cas9 ученые из Военно-медицинского университета (Китай) создали модель мыши, в которой эндогенный белок NPC1L1 был помечен усиленным зеленым флуоресцентным белком (EGFP). Мыши NPC1L1-EGFP позволили исследователям флуоресцентно визуализировать и оценить везикулярный эндоцитоз груза NPC1L1 во время кишечной абсорбции холестерина. Исследование опубликовано в Life Metabolism.

У гомозиготных нокаут-мышей NPC1L1-EGFP был обнаружен нормальный холестериновый гомеостаз на обычной или высокохолестериновой диете. Флуоресценция белка NPC1L1-EGFP локализовалась в щеточной каемке ворсинок (но не крипт) двенадцатиперстной, тощей и подвздошной кишки, но не в толстой кишке. Эта картина соответствует распределению эндогенного NPC1L1 у контрольных мышей. EGFP-положительные везикулы визуализировались под щеточной каемкой уже в течение 5 минут и достигали пика через 15 минут после перорального введения холестерина.

Важно, что везикулы колокализовались с маркером ранних эндосом EEA1 и свободным холестерином, окрашенным филипином. Введение холестерина вызывало накопление EEA1-положительных везикул. Предварительная обработка ингибитором NPC1L1 эзетимибом подавляла образование этих индуцированных холестерином эндоцитарных везикул, что подтверждает роль везикулярного эндоцитоза в поглощении холестерина, опосредованном NPC1L1.

Это исследование впервые наглядно демонстрирует свободный холестерин в эндоцитарных везикулах NPC1L1 во время кишечной абсорбции в физиологических условиях. Оно предоставляет рабочий инструмент для оценки везикулярного эндоцитоза грузов NPC1L1 и абсорбции холестерина in vivo в патофизиологических и фармакологических условиях, что может быть использовано при разработке лекарств.

Кроме того, учитывая, что NPC1L1 также опосредует кишечное поглощение нехолестериновых стеролов (фитостеролов и токоферола), эта модель мыши может быть полезна исследователям в области ситостеролемии и дефицита витамина E.