Две новые линии трансгенных мышей позволят инновационно изучать регуляцию генов
Вариант CRISPR-Cas9 с деактивированной функцией разрезания ДНК, известный как "dCas9", — мощный инструмент для изучения функций генов при изменении их экспрессии, но он имеет ограничения.
Белок dCas9 велик, а типичные векторы доставки генов на основе аденоассоциированного вируса (AAV) способны нести лишь меньший груз. Это создает трудности для использования dCas9 в живых организмах, поэтому исследователи часто полагаются на культивируемые клетки. Однако это не дает полной картины роли генов в более сложных средах.
Группа биоинженеров и геномиков из Центра передовых геномных технологий Университета Дьюка разработала две новые линии трансгенных мышей для направленной регуляции генов с использованием dCas9 in vivo.
Одна линия мышей предназначена для активации генов, другая — для их репрессии. Эти мыши позволяют исследователям изменять эпигенетические состояния и соответствующие уровни экспрессии генов in vivo, чтобы увидеть, как эти изменения влияют на ткани и физиологию целого организма. Работа, выполненная при поддержке Duke Transgenic and Knockout Mouse Shared Facility, опубликована в Nature Methods.
В отличие от нуклеазы Cas9, которая в паре с направляющей РНК (gRNA) разрезает ДНК в специфичных местах, деактивированный белок dCas9 позволяет с аналогичной точностью нацеливаться на участки генома, но модулировать эпигеном, чтобы увидеть эффекты изменений активности генов без изменения последовательности ДНК.
"Изменения последовательностей генов — причина многих наследственных редких заболеваний, — говорит Чарльз Герсбах, профессор биомедицинской инженерии и автор-корреспондент исследования. — Но усиление или ослабление работы генов вызывает больше распространенных болезней, так как они возникают из-за изменений в регуляции генов на протяжении жизни". К ним относятся нейродегенеративные и сердечно-сосудистые заболевания.
Для Энн Уэст, профессора нейробиологии, эта технология означает новый подход к пониманию регуляции генов в постмитотических нейронах мозга. "Вы не можете изменить функцию мозга, создав больше нейронов, — говорит Уэст. — Нужно изменить как работают нейроны, а для этого — какие гены они экспрессируют".
Один из интересующих Уэст генов — Fos, который, как считается, маркирует ансамбль клеток, хранящих память о переживаниях. "Манипулируя эпигенетическим статусом энхансера гена Fos, мы сделали ген более склонным к включению", — объясняет Уэст. Ген Fos включается не в каждой клетке. Теперь лаборатория Уэст может точно настраивать ген, делая его более отзывчивым, чтобы при стимуляции нейронов больше клеток активировали Fos.
"Эта технология позволяет нам проверять причинно-следственные связи между регуляцией генов и активностью нейронных сетей в мозге, приближая к пониманию механизмов обучения и памяти", — говорит Уэст.
Трансгенные мыши полезны не только для нейронов. "С трансгенными животными предела нет, — говорит доктор Мэтт Гемберлинг, постдок, руководивший разработкой мышей. — Вы можете изучать любой орган, любой тип клеток или любой ген на любой стадии развития".
Герсбах и коллеги доказали гибкость подхода, исследуя несколько типов тканей, регулируя активность генов, тестируя разные векторы доставки gRNA, манипулируя клетками ex vivo, изменяя функцию клеток и электрофизиологию мозга.
"Мы хотим показать гибкость, универсальность и надежность трансгенных мышей и сделать этот ресурс доступным для научного сообщества", — сказал доктор Кит Сикленка, соавтор характеристики мышей.
С этой целью Герсбах поместил этих мышей в публичный репозиторий The Jackson Laboratory, и многие лаборатории по всему миру уже запросили и получили их.
"Мы надеемся, что исследователи будут использовать этих мышей со своими собственными направляющими РНК для изучения функции любых генов в любом биологическом процессе, — говорит Герсбах. — Эти мыши помогут продвинуть исследования в области эпигенетики, что позволит лучше понять функции отдельных генов и их продуктов, что будет полезно для поиска мишеней для лекарств против сложных заболеваний".