Масштабирование редактирования генома у микроскопических червей
Изучение эффектов конкретных мутаций в регуляторных областях генов — участках ДНК и РНК, которые включают и выключают гены — важно для понимания работы генома, нормального развития и болезней. Однако систематическое исследование множества мутаций в этих областях — сложнейшая задача. Хотя прогресс достигнут на клеточных линиях и дрожжах, мало исследований проведено на живых животных, особенно в больших популяциях.
Экспериментальные и вычислительные биологи из Центра молекулярной медицины Макса Дельбрюка в Объединении Гельмгольца (MDC) объединились, чтобы создать метод для индукции тысяч различных мутаций у до 1 миллиона микроскопических червей и анализа их влияния на физические признаки и функции.
"В клеточных линиях вы упускаете процессы развития, множество типов клеток, а также взаимодействие между типами клеток, которые влияют на регуляцию генов", — говорит Джонатан Фрёлих, соавтор статьи. — "Теперь мы можем тестировать эти регуляторные последовательности в среде, где они важны, и наблюдать последствия для организма".
Черви встречаются с CRISPR-Cas9
Крошечные черви Caenorhabditis elegans — отличная модель для изучения регуляции генов у человека. "Мы так похожи на них. У них есть специализированные ткани: мышцы, нервы, кожа, кишечник, репродуктивная система. Для исследований регуляции генов важно наличие специализированных типов клеток и развития".
Для эффективной индукции множества мутаций в большой популяции C. elegans исследователи использовали инструмент редактирования генов CRISPR-Cas9. Они определили до 10 участков ДНК, которые должен разрезать фермент Cas9, направляемый к этим точкам РНК. Однако исследователи не давали дополнительных инструкций по репарации, позволяя организмам восстанавливать разрывы ДНК естественными механизмами. Это приводит к разнообразным мутациям в виде делеций или вставок генетического кода, называемых "инделями".
Бросок дротика
В этом эксперименте цель — изучить множество мутаций одновременно, а не быть предельно точными.
"Одна часть контролируема — это дизайн гидовых РНК, указывающих нуклеазе Cas9, куда идти. Но результат полу-случаен", — объясняет Фрёлих. — "Будет много разных исходов, и мы можем увидеть их эффект на животном".
Важно, что исследователям нужно было манипулировать только родительским поколением червей. Они добавили систему Cas9 родителям; при двухчасовом тепловом шоке фермент начал разрезать ДНК в зародышевых клетках. Затем гермафродитные черви размножались, производя тысячи потомков с различными мутациями, без необходимости модифицировать геномы червей по одному.
crispr-DART
Для идентификации мутаций у сотен тысяч червей команда использовала различные методы геномного секвенирования, получив огромный объем данных. Для их анализа они объединились с Платформой биоинформатики и омиксных данных MDC.
Доктор Бора Уяр не нашел существующих инструментов, способных обработать такое разнообразие типов данных и число мутаций. Поэтому он разработал новый программный пакет crispr-DART (Downstream Analysis and Reporting Tool). Название — дань подходу параллельного редактирования, который не всегда приводит к мутациям в целевых областях.
"Поэтому я называю это crispr-DART — вы бросаете дротики в геном, а инструмент говорит, успешны вы или нет", — говорит Уяр.
Программное обеспечение, доступное публично, может обрабатывать различные типы данных секвенирования (длинные/короткие чтения, одиночные/спаренные чтения, ДНК, РНК). Система быстро обрабатывает образцы, помогает оценить эффективность протокола и сравнить мутации с контролем.
Неожиданное открытие
Используя новый протокол, команда связала несколько мутаций в регуляторных областях с конкретными физиологическими эффектами. Они также сделали неожиданное открытие. Долгое время считалось, что два сайта связывания микроРНК в гене lin-41 работают вместе, контролируя экспрессию гена.
С помощью системы параллельного редактирования команда индуцировала мутации в одном сайте, другом, а затем в обоих вместе. Пока хотя бы один сайт оставался нетронутым, черви развивались нормально. Но если мутировали оба сайта, экспрессия гена продолжалась без регуляции, черви не развивались нормально и погибали.
"Это наглядно демонстрирует, как эту систему можно использовать для изучения регуляции генов во время развития", — говорит профессор Николаус Раевски, курировавший проект. — "Мы с нетерпением ждем применения этого подхода параллельного геномного редактирования к новым вопросам".